《Current Eye Research》：Microscopy and Spectroscopy Techniques for Tear Fluid Diagnostics
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本文是一篇关于泪液诊断技术的综述，重点介绍了多种先进显微镜与光谱学方法在泪液生物标志物发现中的应用。文章系统阐述了原子力显微镜（AFM）、荧光寿命成像显微镜（FLIM）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）、表面增强拉曼光谱（SERS）等技术的原理、应用及其在干眼症（DED）、圆锥角膜、多发性硬化症（MS）、糖尿病（DM）、青光眼和抑郁症等疾病检测中的潜力，并指出了当前面临的挑战（如采样标准化、数据解读）和未来发展方向。
显微镜技术
显微镜技术为泪液形态和超微结构分析提供了高分辨率的成像能力。
原子力显微镜
原子力显微镜（AFM）是一种扫描探针技术，能够对泪液干燥样品进行纳米级三维表面形貌成像。它仅需2 μL的样品，但受限于扫描面积小、干燥过程可能引入假象（如蛋白质聚集、盐结晶）以及针尖-样品相互作用的潜在图像伪影。研究显示，与健康对照相比，患有神经系统、精神疾病和眼科疾病的患者，其泪液干燥形态会发生改变。例如，多发性硬化症（MS）患者的泪液样本显示出蕨类形状的枝晶，其表面粗糙度（约70 nm）显著低于健康对照组观察到的更致密、更粗糙的图案（约300 nm）。同样，在重度抑郁症（MDD）患者中，泪液晶体形成了更连续的枝晶网络，具有更短的枝晶，而健康受试者则显示出精细、高度分支的结构。AFM与红外光谱（IR）等振动光谱方法结合（AFM-IR），可以将表面形貌与生化成分直接关联，从而更准确地解读泪膜干燥模式。例如，AFM-IR分析揭示了糖尿病患者泪液样本中酰胺I和II峰的变化，表明糖化引起的蛋白质结构改变、碳水化合物相关红外信号增强，以及与健康对照相比，枝晶形态破坏和表面粗糙度增加。
偏振光显微镜
偏振光显微镜是一种应用于泪液干燥样品的简单且廉价的技术，用于可视化泪液蕨样结晶，这种特征性的结晶模式反映了电解质、蛋白质和黏蛋白的组成。将1–4 μL的泪液滴在载玻片上干燥后，可将其分为四个泪蕨等级，以评估黏蛋白产生情况（I-II级为正常眼，III-IV级为干眼）。在干眼症（DED）中，脂质层功能障碍会加速蒸发并提高电解质浓度，导致更明显和无序的蕨样结晶模式。然而，该技术尚未在临床实践中常规使用，主要原因是缺乏标准化的操作流程。
扫描电子显微镜
扫描电子显微镜（SEM）已用于研究干燥泪液和眼表印迹的表面形态、颗粒物和与治疗相关的超微结构变化。最近，SEM在干眼症（DED）患者的泪液和睑脂中检测到微塑料（聚乙烯和聚氯乙烯）水平升高。这些颗粒可能通过诱导机械刺激、破坏睑脂结构组织和促进局部炎症而导致泪膜功能障碍。此外，SEM结合结膜印迹细胞学技术证明，含有透明质酸、脂质和海藻糖的人工泪液能在上皮上形成均匀、持久的层状结构，并与微绒毛有强相互作用。
透射电子显微镜
透射电子显微镜（TEM）已被用于研究泪液样本中的超微结构成分，特别是细胞外囊泡和纳米级颗粒结构。仅需5–10 μL的泪液，但样品需要负染色、冷冻固定等专门制备。使用负染TEM，研究人员在健康参与者的基础泪液样本中观察到了杯状细胞外囊泡以及由脂质或黏多糖组成的丝状结构。相比之下，糖尿病视网膜病变患者的泪液TEM显示约150 nm的杯状或球形细胞外囊泡。这些观察结果提示了健康个体与糖尿病视网膜病变患者之间在囊泡形态和相关泪液成分上存在细微差异。
荧光寿命成像显微镜
荧光寿命成像显微镜（FLIM）是研究角膜等生物组织的强大工具。与基于比色皿的荧光方法不同，眼表FLIM可以在不收集泪液的情况下在体进行。荧光寿命测量对染料浓度的敏感性低于基于强度的方法。FLIM还展示了用于特定区域泪膜分析的优势，当荧光团放置在接触镜的两侧时，其不同的荧光寿命使得能够选择性地测量镜后泪膜中的钠敏感荧光。
光谱学技术
光谱学技术通过泪液成分与电磁辐射的相互作用，广泛应用于研究泪膜的分子组成、结构和浓度。
质子核磁共振波谱
质子核磁共振（1H NMR）波谱是一种非破坏性技术，通过检测不同化学环境中的氢核来分析泪液中的代谢物。它适用于泪液分析，因其具有高重现性、定量能力和最少的样品制备需求，尽管其灵敏度有限且需要大型仪器。1H NMR代谢组学已显示出区分眼表疾病的强大潜力。例如，在泪液分泌不足（ATD）和睑板腺功能障碍（MGD）患者的泪液中发现了不同的代谢差异。在原发性开角型青光眼（POAG）患者中，识别出了一个判别代谢物组，其中泪液中苯丙氨酸、苯乙酸和亮氨酸减少，而牛磺酸、甘氨酸、尿素、葡萄糖和不饱和脂肪酸增加。
拉曼光谱
拉曼光谱通过检测泪液中化学键的振动频率来表征分子结构。该技术通常需要≤ 3 μL的泪液，并常将其干燥在氟化钙、石英或金等惰性基底上以增强信号强度。拉曼光谱已应用于泪液，以获得蛋白质、脂质和其他泪液成分的分子指纹，且样品制备最少，水干扰有限。然而，微弱的拉曼信号通常需要信号增强策略，并且泪液成分的荧光背景可能掩盖诊断相关的光谱特征。在多发性硬化症（MS）患者的泪液中，拉曼光谱显示苯丙氨酸和色氨酸的信号强度低于健康受试者。相比之下，表面增强拉曼光谱（SERS）通过使用金属纳米结构极大地放大拉曼信号，克服了拉曼光谱的灵敏度限制。
圆二色光谱
圆二色光谱（CD）用于研究泪液中的手性生物分子，包括对眼表健康至关重要的碳水化合物和糖蛋白。然而，CD在泪液分析中的应用受到样品体积的限制。基础泪液库每只眼仅约7 μL，而远紫外CD需要数十微升样品和0.1–0.5 mg/mL范围的蛋白质浓度。尽管存在这些限制，CD光谱已揭示了重度抑郁症（MDD）患者泪液蛋白质的结构变化，表现为远紫外CD光谱的可重复性变化，特别是与健康对照相比，α-螺旋相关波段（约208 nm附近）发生红移。
傅里叶变换红外光谱
傅里叶变换红外（FTIR）光谱能够利用特征吸收频率快速识别泪液的主要成分，包括脂质、蛋白质、核酸和碳水化合物。对于FTIR光谱，样品通常通过短暂离心以去除碎片，然后以微升体积（0.5–2 μL）沉积到ATR晶体或红外透明基底上形成均匀薄膜。FTIR光谱对储存和干燥条件高度敏感，清晰的报告对于可重现的分析至关重要。FTIR光谱已证明对一系列全身性和眼部疾病相关的泪液生化改变具有敏感性。在圆锥角膜中，FTIR光谱通过识别蛋白质和脂质变化（特别是CH2和CH3脂质脂肪链），实现了早期疾病检测。在重度抑郁症（MDD）中，泪液的FTIR分析揭示了酰胺I和酰胺II蛋白质带的显著变化。在糖尿病（DM）患者中，FTIR揭示了特征性泪液枝晶结构的进行性破坏，这是由于葡萄糖诱导的溶菌酶降解所致。
能量色散X射线光谱
能量色散X射线（EDX）光谱已应用于干燥的泪液残留物，以表征泪膜的元素组成。利用电子束诱导的X射线发射，EDX可检测泪液中的主要无机成分，包括钠、钾、氯、碳和氧。研究报道了与健康对照相比，干眼综合征、原发性开角型青光眼（POAG）和多发性硬化症（MS）患者的元素比例（特别是Na+/K+平衡）发生了改变。这些变化反映了泪液电解质稳态的破坏。结合SEM，EDX已被用于分析Schirmer试纸上的眼表颗粒物。
荧光技术
荧光技术包括稳态荧光光谱、F?rster共振能量转移（FRET）和同步荧光光谱，当使用微体积或纳体积比色皿时通常需要1–20 μL。泪液样本必须短暂离心以去除碎片，并在适当时稀释到低荧光、低离子强度的缓冲液中。因为泪液含有内源性蛋白质荧光团，并且蛋白质、脂质和盐的组成可变，荧光测量对自发荧光、散射和微环境依赖性光谱位移敏感。储存条件会进一步加剧荧光变异性。冷冻、冻融循环、储存温度和干燥会改变蛋白质构象、脂质组织和水合状态。稳态荧光光谱已被应用于泪液研究，以追踪脂质-蛋白质相互作用，定量磷脂向泪液脂质运载蛋白的转移，并评估病理眼表面的脂质结合。FRET因其高灵敏度而被广泛应用于生物传感器设计。近年来，基于FRET的生物传感器已成功应用于泪液分析。同步荧光光谱提高了泪液分析中的光谱分辨率，使其更容易检测复杂泪液基质中的成分变化。在重度抑郁症（MDD）患者中，观察到约280 nm处的荧光强度显著增加。泪液的三维同步荧光光谱结合二阶导数分析和机器学习方法，能够基于特征性光谱指纹区分青光眼患者和健康个体。
局限性与未来方向
尽管显微镜和光谱学在泪液诊断中应用前景广阔，但仍有若干挑战阻碍其广泛应用。一个显著问题是泪液采集方法（如Schirmer试纸和毛细管）的变异性，这可能导致结果不一致。需要标准化的泪液收集和干燥方案以确保研究的可重复性和准确性。Schirmer试纸对患者友好，但可能含有污染物，如纸纤维或痕量元素，这些可能干扰分析。在泪液文献中，大多数基于光谱学的研究使用原始或相对缩放强度评估光谱差异，而未进行生化标准化。由于泪液样本在蛋白质浓度、脂质组成和溶质含量上存在显著差异，缺乏标准化归一化策略增加了观察到的差异反映样品浓度变化而非真实分子变化的风险。此外，从患者获取的泪液量有限，对全面分析提出了挑战。必须改进灵敏的分析方法以最大化利用小样本数据。虽然已经确定了潜在的生物标志物，但很少在大型、多样化人群中得到验证。未来的研究应以多中心研究、技术创新和跨学科合作为主要策略，以克服这些限制。
结论
泪液诊断的最新进展反映了生物分析创新与临床需求的结合。高分辨率显微和光谱方法的应用为眼表病理生理学和全身性疾病表现提供了新的见解，揭示了泪液成分（包括蛋白质、脂质和代谢物）的变化。虽然一些高分辨率技术仍主要是研究工具，但基于荧光的方法、FTIR以及拉曼/SERS可能因其高灵敏度和低样本需求而提供更实用的临床转化途径。它们在泪液诊断中的整合可能进一步实现早期、无创的疾病检测。持续的技术发展、标准化和跨学科合作对于将用于泪液分析的显微镜和光谱学技术确立为个性化医学中的可靠工具至关重要。
