人类大脑类组装体中的人源小胶质细胞展示区域特异性多样性并对携带SCN2A突变的多动神经元做出响应

《SCIENCE ADVANCES》：Human microglia in brain assembloids display region-specific diversity and respond to hyperexcitable neurons carrying SCN2A mutation

小胶质细胞在神经元环路发育和功能塑造中至关重要，但其在人脑中的区域特异性及其在神经精神疾病相关环路（如中脑-纹状体环路）中的作用机制尚不明确。为此，研究人员构建了包含人源小胶质细胞的区域特异性大脑类器官和组装体模型。他们通过单细胞RNA测序揭示了六种具有区域特征的小胶质细胞亚型，并发现富含GABAB受体的小胶质细胞能响应SCN2A突变引起的神经元过度兴奋，导致钙信号增强和突触过度修剪。此过程可被GABAB受体抑制逆转。该研究为解析人类神经免疫互作及评估相关疗法提供了新平台。

　　

大脑中居住着一群特殊的“清道夫”兼“园丁”——小胶质细胞。作为中枢神经系统的主要免疫细胞，它们不仅负责清除“垃圾”，更在神经元成熟、突触修剪和神经环路组装等关键发育过程中扮演着不可或缺的角色。近年来，越来越多证据表明，小胶质细胞并非千篇一律，它们在不同的大脑区域可能展现出不同的“性格”与功能，这种区域特异性与多种神经精神疾病的发病机制密切相关。然而，对于人类，尤其是皮层下区域（如纹状体、中脑）小胶质细胞的区域异质性及其在特定神经环路（如与自闭症谱系障碍紧密相关的中脑-纹状体环路）中的作用，我们知之甚少。

为了填补这一关键空白，一项发表于《SCIENCE ADVANCES》的研究构建了一个前沿的人类细胞模型平台。研究人员将人诱导多能干细胞（human induced pluripotent stem cells, hiPSCs）来源的“初始”小胶质细胞，与同样由hiPSCs分化而来的、代表不同脑区（皮质、纹状体、中脑）的类器官进行共培养，成功建立了“小胶质细胞-类器官”整合模型。为了模拟跨脑区的神经连接，他们进一步将包含小胶质细胞的中脑类器官与纹状体类器官融合，创建了“中脑-纹状体-小胶质细胞”组装体。这一精巧的设计，使得在三维、具备一定组织结构的人类细胞系统中，实时研究小胶质细胞在特定神经环路中的行为和功能成为可能。

研究人员运用了多项关键技术来探索这个模型。首先，他们通过单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）对三类整合小胶质细胞的类器官进行转录组分析，以揭示小胶质细胞的分子异质性。其次，利用化学遗传学（chemogenetics）工具特异性激活组装体中的中脑神经元，并结合高密度微电极阵列（high-density multielectrode array, HD-MEA）记录和活细胞钙成像（live calcium imaging）技术，实时监测神经元活动及其引发的小胶质细胞反应。再者，他们引入了与严重自闭症相关的SCN2A无义突变（C959X），在组装体中模拟疾病状态。最后，通过药理学阻断（使用GABA_B受体拮抗剂CGP 55845）和基因敲除（GABBR1KO）手段，来验证特定信号通路在观察到的现象中的作用。所有使用的细胞系均为hiPSC来源，包括等基因对照和基因编辑的突变系。

研究结果层层递进，揭示了小胶质细胞在区域特化和神经环路中的复杂作用。

hCO-Mg、hStrO-Mg和hMO-Mg模型揭示了不同人脑类器官中空间相关的小胶质细胞异质性

通过将未特化的小胶质细胞与皮质、纹状体或中脑类器官共培养，研究人员成功建立了三个模型：hCO-Mg（人皮质类器官与小胶质细胞）、hStrO-Mg（人纹状体类器官与小胶质细胞）和hMO-Mg（人中脑类器官与小胶质细胞）。小胶质细胞成功整合到类器官中，其形态随培养时间发生变化。scRNA-seq分析在整合的数据集中识别出六个不同的小胶质细胞亚群（A至F簇），它们在不同脑区类模型中呈现出显著的富集模式。例如，A簇（人-细胞增殖-小胶质细胞，H-CP-MG）主要富集于hCO-Mg；B簇（人-刺激反应-小胶质细胞，H-SR-MG）显著富集于hStrO-Mg；而D簇（人-免疫反应-小胶质细胞，H-IR-MG）则主要出现在hMO-Mg中。特别值得注意的是，纹状体类器官中的小胶质细胞整体上表现出多种GABA受体相关基因（如GABBR1）的富集，其中B簇的表达尤为突出。这些发现为人类小胶质细胞在转录水平上的区域特异性异质性提供了有力证据。

小胶质细胞促进轴突投射并增强组装体形成

为了研究小胶质细胞在神经连接中的作用，研究人员构建了微胶质细胞整合的皮质-纹状体组装体（hCO-hStrO-Mg）和中脑-纹状体组装体（hMO-hStrO-Mg）。利用病毒标记和活体成像技术，他们观察到，与不含小胶质细胞的对照组相比，整合了小胶质细胞的组装体表现出显著增强的中脑到纹状体的轴突投射，并且融合成功率更高。HD-MEA记录结合多巴胺受体阻断实验证实，重建的中脑-纹状体环路是特异且功能成熟的。这些结果表明，小胶质细胞积极促进轴突投射，显著增强了中脑-纹状体环路的组装和功能整合。

小胶质细胞对hMO-hStrO组装体中纹状体区域升高的神经元活动产生响应

研究人员利用化学遗传学方法特异性激活中脑-纹状体环路，发现这能有效提升纹状体区域的神经元放电活动。随后，他们通过活细胞钙成像监测纹状体区域小胶质细胞的反应。在基础条件下，小胶质细胞的胞体和突起表现出极小的自发钙活动。然而，在化学遗传学激活环路后，纹状体区域小胶质细胞的胞体和突起均表现出强烈的钙信号增加。免疫染色证实了GABA_B受体在小胶质细胞上的存在。当使用选择性GABA_B受体拮抗剂CGP 55845进行处理，或使用GABBR1基因敲除（GABBR1KO）的小胶质细胞时，化学遗传学激活所诱发的小胶质细胞钙信号升高被显著抑制。这些数据共同证明，小胶质细胞通过其GABA_B受体感知中脑-纹状体环路的神经元活动。

小胶质细胞通过GABA_B受体依赖性钙信号传导和过度突触修剪对过度兴奋的SCN2A-C959X组装体产生响应

研究人员在中脑-纹状体组装体中引入了与自闭症相关的SCN2A无义突变（C959X）。电生理记录证实，突变组装体中的中等多棘神经元（medium spiny neurons, MSNs）表现出动作电位发放显著增加，即神经元过度兴奋的表型。活细胞钙成像显示，与野生型对照组相比，突变组装体中纹状体区域的小胶质细胞其胞体和突起的钙活动均显著升高。进一步的免疫荧光三维重建分析表明，突变组装体中的小胶质细胞其溶酶体体积增大，并且对VGAT阳性的抑制性突触前终末的吞噬作用增强，表明存在抑制性突触的过度修剪。关键的是，无论是药理学抑制GABA_B受体，还是使用GABBR1KO的小胶质细胞，都能有效减弱这种突变引起的钙信号升高和VGAT吞噬增加。突触共定位分析也支持小胶质细胞的GABA_B受体参与了抑制性突触缺陷。这些发现表明，小胶质细胞通过GABA_B受体依赖性的钙信号通路，响应SCN2AC959X突变诱导的神经元过度兴奋，并导致了抑制性突触的过度修剪。

在讨论与结论部分，该研究强调其建立了一个强大的平台，可用于剖析人类大脑皮层下区域的神经免疫相互作用，并评估此前未知的治疗方法。研究首次在人类细胞模型中系统揭示了小胶质细胞在皮质、纹状体和中脑区域的特异性转录特征，特别是在富含GABA能神经元的纹状体中，小胶质细胞显著富集GABA_B受体。利用化学遗传学结合活细胞成像，研究直接证明了这些纹状体小胶质细胞能够动态响应中脑-纹状体环路的神经元活动，且这一过程依赖于GABA_B受体。更重要的是，在模拟自闭症的SCN2A突变模型中，小胶质细胞通过同样的GABA_B受体途径，表现出异常的钙信号和突触过度修剪，而阻断该通路则可以逆转这些病理表型。

这项研究的意义在于：首先，它提供了在复杂三维人类神经环路中研究小胶质细胞区域特异性和功能的先进工具，弥补了传统二维培养、脑片或体内成像技术对皮层下区域研究的不足。其次，它揭示了一条之前未知的、由神经元过度兴奋触发，经由小胶质细胞GABA_B受体介导，最终导致突触病理的神经免疫轴，为理解自闭症等神经精神疾病的发病机制提供了新视角。最后，该平台及其发现为针对微环境特异性小胶质细胞功能开发精准治疗策略（例如靶向GABA_B受体）提供了概念验证和评估体系。尽管该模型系统目前缺乏血管成分，且主要聚焦于早期发育阶段，但它无疑为在人类细胞背景下探索小胶质细胞生物学及其在脑疾病中的作用开辟了新的道路。