《SCIENCE ADVANCES》：3D reconstruction of human liver tissue at cellular resolution
编辑推荐：
传统二维组织学在理解肝脏复杂三维结构方面存在局限。本研究开发了LiverMap技术，首次实现了多肝小叶尺度的人类肝脏三维细胞分辨率重建，并揭示了肝硬化组织中中央静脉网络退化、肝动脉网络紊乱、胆管网络碎片化以及肝窦内皮细胞CD32b空间表达失调等一系列促门脉化/去中心化的病理性结构重塑特征。
肝脏，人体内功能最为复杂的器官之一，其高效的代谢、解毒、合成等功能，离不开内部高度有序的微观结构。想象一下，肝脏由数百万个名为“肝小叶”的基本功能单元组成，它们像蜂巢一样紧密排列。每个肝小叶都是一个精密的“化工厂”：富含营养的血液从肝小叶边缘的“门管区”流入，经由像迷宫一样的肝血窦网络缓慢渗透到中央的“中央静脉”流出。在这个过程中，肝细胞分区域（即“分区化”）执行着不同的代谢任务。肝脏的功能与其三维空间结构紧密相连，一旦这个精密的建筑结构被破坏，功能就会出现障碍，最终可能导致肝硬化。
肝硬化是多种慢性肝病的终末阶段，其标志是肝脏内形成大量瘢痕（纤维化）组织，导致正常的肝脏结构被彻底打乱。遗憾的是，目前临床上评估肝病的“金标准”——二维组织病理学切片，在揭示肝脏复杂的立体结构方面存在先天不足。把一块立体的肝脏组织切成薄片观察，就像是通过一片薄面包去猜测整个面包的结构，很容易误判或遗漏关键的立体结构信息。此前，虽然在小鼠肝脏中已实现一些三维成像，但对人类肝脏，尤其是在多肝小叶尺度上的三维细胞分辨率研究仍是空白。我们不知道在肝硬化发生时，人类肝脏那精密的血管和胆管网络究竟是如何被重塑的，这些结构变化又如何导致了肝功能衰竭。为了解决这一难题，研究人员在《SCIENCE ADVANCES》上发表了一项开创性研究。
为了开展这项研究，研究人员从接受手术的患者（部分肝切除的非纤维化组织和移植的肝硬化组织）中获取了人类肝脏样本，并开发了一套名为“LiverMap”的标准化流程。该流程的核心技术方法包括：使用多种特异性抗体进行免疫荧光多重染色，以标记肝脏中的关键细胞和结构（如肝细胞、肝窦内皮细胞、中央静脉、门静脉、肝动脉、胆管等）；利用适用于富含脂质全组织样本的Ce3D方案对组织进行光学透明化处理；采用激光共聚焦显微镜对大体积组织块（约4毫米 x 4毫米 x 500微米）进行三维拼图成像；最后，运用Imaris和Vesselucida等商业软件对成像数据进行三维重建、可视化及定量分析。
研究结果主要包括以下几个方面：
LiverMap pipeline for 3D visualization of human liver tissue
研究人员成功建立了LiverMap流程，能够对包含多个相邻肝小叶的人类肝脏组织块进行三维细胞分辨率成像和重建，成像体积比前人研究放大了约1600倍。
Multiscale visualization of architectural features of human liver tissue
利用该流程，研究人员首次在三维空间中可视化了多个肝小叶的镶嵌排列，测量了人类肝小叶的平均多边形半径（约595微米），并清晰地重建了门管区内的门静脉、肝动脉、胆管网络，以及肝小叶内的肝血窦和胆小管网络的三维拓扑结构。特别是，他们观察到肝窦内皮细胞（LSECs）的标志物CD32b的表达呈现从肝小叶中央向门管区递减的梯度模式
Dysregulation of human hepatocyte and sinusoidal CD32b spatial expression in cirrhosis
通过比较非纤维化（正常）和肝硬化组织，研究发现肝硬化组织中CD32b+LSECs的空间表达模式发生显著失调，其规则的放射状梯度表达模式被破坏。同时，肝硬化组织中表达谷氨酰胺合成酶（GS）的中央静脉周围肝细胞体积显著减少。
Alterations to liver vascular networks in cirrhotic tissue
三维血管网络重建显示，与正常组织相比，肝硬化组织的中央静脉网络在数量、总体积和末端分支数上都显著减少，表明中央静脉网络发生退化。此外，肝动脉网络（CD31+微血管）的结构在不同病因的肝硬化样本中呈现不同的紊乱模式。
Architectural changes of the biliary network in cirrhosis
对胆管网络（CK19+）的分析表明，肝硬化组织的胆管结构呈现高度异质性，且普遍呈现出“碎片化”特征。定量分析显示，肝硬化组织平均拥有更多数量、更小体积的CK19+结构片段，胆管网络连接性被破坏。
本研究的主要结论与重要意义在于：
研究者开发的LiverMap流程首次实现了人类肝脏在多肝小叶尺度上的三维细胞分辨率成像，为肝脏结构研究提供了强大新工具。通过对非纤维化与肝硬化组织的三维比较分析，研究揭示了肝硬化伴随着一系列协调性的结构重塑：肝窦CD32b空间表达失调、GS+肝细胞减少、中央静脉网络退化、肝动脉网络紊乱以及胆管网络碎片化。这些发现共同指向肝硬化组织存在一种“促门脉化/去中心化”的表型。中央静脉的减少可能影响肝脏血液流出，与临床观察到的门静脉高压相关；GS+肝细胞的缺失可能意味着氨代谢能力下降，增加高氨血症风险；而胆管网络的碎片化则可能阻碍胆汁流动。这项工作不仅从三维空间角度深化了对肝硬化病理生物学的理解，将以往在二维切片中观察到的零散现象整合为连贯的立体病理图景，而且其定量分析框架（如胆管碎片化指数）为未来评估疾病进展和治疗效果提供了新的潜在生物标志物。最终，这些关于结构-功能关联的新见解，有望启发针对肝硬化结构性缺陷的新治疗策略。
