《SCIENCE ADVANCES》：Tuning of the RBR1-E2F/DP transcriptional module by the F-box protein FBL17
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为解决植物F-box蛋白FBL17功能机制不清的难题，研究人员聚焦其与RBR1-E2F/DP转录模块的相互作用，通过遗传与分子互作研究发现，FBL17通过调控E2Fa/b的蛋白周转来影响转录网络，而E2Fc的异常积累是导致fbl17突变体致死的关键。这项发表于《SCIENCE ADVANCES》的研究揭示了植物细胞周期稳态调控的新层次。
在真核生物中，细胞周期的精确运行对生命活动至关重要。植物如何精确调控细胞分裂与分化，确保生长发育正常进行，一直是科学界的核心问题。在这个过程中，一类名为F-box的蛋白扮演着“质量检查员”的角色，它们作为SCF（Skp1–Cullin–F-box-protein）型泛素连接酶复合体的特异性识别亚基，负责给需要被清除的靶蛋白“贴上”泛素标签，引导其进入蛋白酶体被降解，从而实现蛋白质稳态的快速调控。在拟南芥中，F-BOX-LIKE17（FBL17）就是这样一位关键的“质量检查员”。它被认为是哺乳动物Skp2蛋白在植物中的功能同源物，对DNA复制、DNA损伤应答以及最近的细胞大小控制都起着核心作用。然而，一个令人困惑的现象是，fbl17功能缺失突变体会表现出严重的细胞缺陷并导致植株死亡，这表明它的功能远比降解一两个已知底物（如细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂KRP蛋白）更为复杂和关键。那么，FBL17究竟是通过什么样的分子“杠杆”来撬动全局的细胞周期调控网络，其突变致死的根本原因又是什么？这正是本篇研究旨在揭示的核心谜题。
发表在顶级期刊《SCIENCE ADVANCES》上的这项研究，为我们拨开了这层迷雾。研究团队综合运用了遗传学分析、蛋白质组学、转录组学、多种蛋白质互作验证技术以及染色质免疫共沉淀测序等关键方法。他们构建了fbl17与三个典型E2F转录因子（E2Fa, E2Fb, E2Fc）的双突变体，并系统比较了它们的表型。利用免疫沉淀-质谱联用技术解析了FBL17的相互作用蛋白质组。通过酵母双杂交、双分子荧光互补、分裂荧光素酶以及体外泛素化与降解实验，验证了蛋白质间的直接相互作用与功能。通过染色质免疫共沉淀测序分析了E2Fc在全基因组范围内的DNA结合变化。
研究结果部分通过一系列精心设计的实验，层层递进地揭示了FBL17的作用机制：
The severe FBL17 loss-of-function phenotype is suppressed by the e2fc mutation
研究人员首先将fbl17突变分别与e2fa、e2fb、e2fc突变进行杂交。结果出人意料：fbl17 e2fa双突变体的表型比fbl17单突变体更严重，而fbl17 e2fb双突变体甚至无法获得（表现为合成致死）。与之形成鲜明对比的是，fbl17 e2fc双突变体却展现出惊人的表型“拯救”效果。与严重发育迟缓、器官细小、根尖分生组织紊乱且不育的fbl17单突变体相比，fbl17 e2fc双突变体在莲座叶大小、根长、花粉育性以及叶片表皮细胞的大小和数量上都恢复到了接近野生型或e2fc单突变体的水平。此外，fbl17突变体中严重受损的内复制（核内DNA含量倍增）水平，在双突变体中也在子叶和叶片中得到了显著恢复。这些数据首次明确地将e2fc鉴定为能够逆转FBL17功能缺失严重表型的突变。
The misexpression of cell cycle and DDR genes in fbl17 is markedly attenuated by the e2fc mutation
此前的研究已知fbl17突变体中大量细胞周期和DNA损伤应答（DDR）相关基因被异常上调表达。本研究通过RT-qPCR（逆转录定量聚合酶链式反应）发现，在fbl17 e2fc双突变体中，这些基因的异常高表达得到了显著减弱。然而，这种减弱是部分且基因特异性的。同时，尽管DDR基因表达有所下调，fbl17 e2fc植株对DNA损伤试剂（zeocin）的敏感性并未恢复，依然与敏感的atm-2突变体相当，这表明其DNA损伤修复能力并未完全恢复。但重要的是，fbl17中观察到的根尖组成性细胞死亡现象在双突变体中消失了。
Components of the RBR1/E2F module are part of the FBL17 interactome
为了从分子层面探究FBL17如何发挥作用，研究人员通过免疫沉淀-质谱联用技术绘制了FBL17的相互作用蛋白质组。结果发现，FBL17的互作蛋白中显著富集了RBR1-E2F/DP转录模块的多个组分，包括RBR1、E2Fa、E2Fb、DPa和DPb，以及植物DREAM复合物（DP, RBR1, E2F, and MYB）的其他成员。令人意外的是，此前被认为是潜在底物的KRP蛋白并未被检测到。进一步的免疫印迹分析证实，在fbl17突变体中，RBR1蛋白（包括其磷酸化形式）和E2Fa蛋白的稳态水平确实升高了。通过一个报告株系，研究人员还发现E2Fc蛋白在fbl17突变体中也存在强烈的积累。
FBL17 directly interacts with E2Fa and E2Fb and is involved in their protein turnover
那么，FBL17是否直接调控这些E2F蛋白呢？一系列互作和功能验证实验给出了肯定的答案：在拟南芥原生质体、酵母和本氏烟草中的实验均证实，FBL17能直接与E2Fa和E2Fb相互作用，但与E2Fc的互作很弱或不明显。在fbl17突变体背景的原生质体中共同表达FBL17-GFP和E2Fa/b-Flag时，会以剂量依赖的方式显著降低E2Fa/b的蛋白水平，而对E2Fc的影响很小。体外降解和泛素化实验进一步证明，FBL17-His的存在能促进E2Fa和E2Fb的泛素化及降解，但对E2Fc的作用很弱。活体成像显示，在根尖细胞核中，FBL17与E2Fa存在动态的共定位，且FBL17信号达到峰值时，E2Fa信号处于低谷，这暗示了FBL17参与E2Fa蛋白周转的时空特异性。
The capacity of E2Fc to bind chromatin is abrogated in the absence of FBL17
既然FBL17不直接降解E2Fc，那为何e2fc突变能挽救fbl17的表型？为了解答这个问题，研究人员利用染色质免疫共沉淀测序技术分析了E2Fc在全基因组范围内的DNA结合情况。结果发现，在野生型背景下，E2Fc能结合1327个靶基因的启动子区域，其中显著富集了经典的E2F结合基序。然而，在fbl17突变体背景下，尽管E2Fc蛋白大量积累，但其在染色质上的结合能力却显著降低。RNA-seq（RNA测序）分析显示，在fbl17中异常上调、且这种上调在fbl17 e2fc中被逆转的基因中，有125个是E2Fc的直接靶基因，它们显著富集于DDR、DNA复制和DNA修复等功能。对其中一个靶基因BARD1的分析进一步表明，在fbl17中，不仅E2Fc结合丧失，其共抑制因子RBR1的结合也随之消失，而在fbl17 e2fc双突变体中，RBR1的结合得以恢复。细胞分馏和荧光成像实验排除了E2Fc核定位改变的可能性，表明其DNA结合活性的丧失是功能性的。
研究在结论与讨论部分对上述发现进行了整合与阐释。首先，研究明确了FBL17的直接蛋白靶点。尽管FBL17被认为是KRP蛋白的潜在降解者，但本研究的蛋白质组学数据并未支持这一点，而是首次揭示了FBL17与RBR1-E2F/DP模块组分的直接相互作用。FBL17能够直接结合并促进E2Fa和E2Fb的泛素化与降解，这为理解细胞周期转录因子的蛋白稳态调控提供了新视角。然而，E2Fa和E2Fb的积累并非fbl17致死表型的主因，因为它们的突变并未挽救反而加重了fbl17的表型。
研究最关键、最出人意料的发现是确立了E2Fc作为细胞周期与DNA损伤基因表达的主要抑制因子在fbl17致死机制中的核心地位。在fbl17突变体中，尽管E2Fc蛋白大量积累，但它失去了结合染色质并招募RBR1形成抑制性复合物的能力，导致大量DDR等基因的转录抑制被解除，构成性激活，最终引发严重的细胞周期缺陷和DNA损伤应答。而敲除E2Fc则移除了这个功能异常的“刹车失灵”的抑制因子，从而挽救了整个系统的崩溃。这一机制完美解释了为何降解E2Fa/b的FBL17失活后，其最致命的后果却源于一个它并不直接降解的转录抑制因子E2Fc的功能失调。
综上所述，这项研究揭示了一个精细而关键的调控回路：F-box蛋白FBL17通过调控E2Fa/b的蛋白周转，间接影响了E2Fc的染色质结合活性及其转录抑制功能。FBL17的功能缺失导致E2Fc虽然积累但功能失活，无法有效抑制其靶基因（尤其是DDR相关基因），从而引发了灾难性的转录失调和细胞死亡。该研究不仅阐明了fbl17突变体致死的分子根源，将E2Fc推向了调控网络的中心位置，也为理解植物如何通过SCF泛素化系统精确调谐RBR1-E2F/DP这一核心转录模块，以协调细胞周期进程与基因组稳定性维护提供了全新的机制见解。获得可存活的fbl17 e2fc双突变体，也为未来进一步深入探究FBL17在细胞周期及其他生理过程中的广泛底物与功能打开了大门。
