揭示穹窿粒子帽区13重对称与39重主体不匹配的原子级结构及其在分子运输与工程改造中的意义

《SCIENCE ADVANCES》：The vault particle is enclosed by a C13-symmetric cap with a positively charged exterior

本刊推荐：穹窿作为真核细胞中高度保守的核糖核蛋白复合体，其功能及关键结构细节不明。研究人员采用冷冻电镜技术解析了兔肝来源穹窿粒子的帽区高分辨结构，意外发现其具有13重对称，与主体的39重对称形成鲜明对比，并揭示了一个由两个同心β桶和交错α螺旋层组成的中心通道，其外表面带正电、内表面带负电。这项成果为理解穹窿结构及其在药物递送等生物技术应用中的设计提供了关键见解。

　　

穹窿是真核细胞中普遍存在的巨型核糖核蛋白复合体，自1986年首次发现以来，其独特的桶状结构吸引了科学家的目光。然而，尽管对其主体部分的结构已有相当了解，穹窿两端的“帽子”区域一直如同谜团。这些帽子是如何构成的？它们与穹窿主体39重对称的完美桶身之间是否存在结构上的“不协调”？更重要的是，穹窿如何在细胞中穿梭、装载并释放货物，甚至在癌症耐药性、免疫调节等生理和病理过程中发挥作用？为了解答这些根本性问题，研究者们将目光投向了这一保守却神秘的细胞器结构细节。

最新发表于《SCIENCE ADVANCES》的研究，通过高分辨率冷冻电子显微镜（cryo-EM），揭开了穹窿帽区的神秘面纱。为了阐明穹窿的整体结构，特别是其帽区的精细构型，研究人员从兔肝中纯化了天然的穹窿粒子，并利用配备K3探测器的Titan Krios冷冻电镜收集了数据。他们采用了基于石墨烯氧化物的载网，并结合了局部处理和对称性分析等关键技术，最终成功解析了穹窿帽区高达2.25埃分辨率的原子结构。

高分辨率结构测定

研究人员从兔肝中纯化得到包含主要穹窿蛋白（MVP）、端粒酶相关蛋白1（TEP1）和穹窿PARP（vPARP）的完整穹窿颗粒。通过冷冻电镜分析，他们获得了整体穹窿的初始重构，确认了其桶状的D₃₉对称性结构，长700 ?，宽约400 ?。然而，帽区的密度图仍无法解释，这促使他们对帽区进行局部分析。通过对称性扩展、亚颗粒提取和局部分类，研究人员最终确定了帽区具有C₁₃对称性，这与主体C₃₉对称形成鲜明对比。帽区的结构由13个重复的不对称同源三聚体（每个三聚体包含VA、VB、VC三种构象的原体）构成，从而完成了整个穹窿壳的模型。

穹窿帽的结构特征

穹窿帽的核心结构是一个紧密折叠的平面盘，由一个两层的双层桶状结构组成。具体而言，VB和VC的α₁螺旋构成外层；由VA形成的外环和VB形成的中环构成内层。VB和VC链共同折叠形成了两个同心的β桶：一个由VB-β₁和VC-β₁组成的26股“外桶”，以及一个仅由VC-β₂形成的13股“内桶”。VA、VB、VC三种原体通过特定的疏水界面相互作用，特别是VC链像一个桥梁，连接了VA和VB链。这种独特的三聚体构象导致三个化学性质相同的原体（VA, VB, VC）折叠出截然不同的形态。

内桶形成连接穹窿腔与胞质的动态通道

由VC链形成的内桶构成了连接穹窿内腔和细胞质的通道。该通道最狭窄处直径约为15 ?，很可能由残基N840和F842构成。这个通道足够允许小分子、离子甚至可能的肽段扩散。虽然该区域的密度图质量稍逊，清晰度不如周围区域，且大部分侧链密度缺失，这可能表明内桶具有一定柔性或动态性。

穹窿帽形成一个外带正电、内带负电的平面盘

静电分析显示，穹窿帽外表面有一个由VB和VC链的K828残基形成的带正电环。这个带正电的特征很可能介导了与核酸、阴离子脂质或其他带负电伙伴的相互作用。K828在脊椎动物中是保守的。同时，穹窿帽内部存在一个带负电区域，可能形成一个静电阱，用于保留或排斥小分子或离子。

穹窿帽的结构显示出与SPFH家族蛋白的相似性

穹窿帽的双同心β桶结构与SPFH（stomatin, prohibitin, flotillin, HflK/C）蛋白超家族成员的结构相似。例如，HflK/C复合物的异源二聚体也组装成一个C₁₂对称的同心桶，其外桶由HflC贡献，内桶由HflK贡献。类似的，flotillin复合物、内质网驻留的Erlin复合物以及线粒体的prohibitin复合物都形成了具有相似结构原理的高阶组装体。然而，穹窿帽有其独特性：它由13个拷贝的不对称同源三聚体构成，而大多数其他SPFH家族成员是异源组装体。

穹窿帽的静电特性对与结合伴侣和细胞区室的关联具有启示意义

穹窿帽外表面带正电的特性与其和微管的末端相互作用一致，表明这种结合更可能通过帽区而非穹窿的桶状结构域发生。此外，这为穹窿RNA（vRNAs）的可能结合位点提供了线索：鉴于帽区外表面带正电而内部带负电，如果vRNAs直接与穹窿帽相互作用，更可能发生在外表面以最大化静电吸引。

对设计和改造修饰穹窿粒子的启示

该研究为理性设计和改造穹窿粒子提供了结构基础。已知穹窿由一个不对称同源三聚体组装而成，工程化努力可集中于生成异源三聚体或异源二聚体穹窿，以选择性稳定每种原体的构象。例如，截短VA-α₂和VA-α₃之间的片段以限制其柔性，可能更利于VB链构象；或将VC链的G847突变为丙氨酸可能增加该区域的α螺旋倾向，进一步稳定目标结构。这些修饰可用于控制穹窿组装并提高功能特异性，例如在穹窿内部精确融合货物或在朝向胞质的特定原体上展示靶向基序，从而拓展穹窿在靶向药物递送、分子运输或合成生物学中的应用潜力。

结论与讨论

本研究通过高分辨率冷冻电镜揭示了穹窿帽区出人意料的C₁₃对称结构，与主体D₃₉对称形成鲜明对比。帽区由一个紧密折叠的双层同心β桶和一个连接穹窿内腔与胞质的约15 ?通道组成。其外表面带正电、内表面带负电的静电特性，为解释其与微管、vRNA等结合伙伴的相互作用提供了结构依据。该结构与SPFH蛋白家族成员的相似性，暗示了功能或进化上的关联。这项研究填补了穹窿结构认知的关键空白，不仅加深了对其基本生物学功能（如细胞内运输、免疫调节、药物抵抗）的理解，更重要的是，为将穹窿工程化为可控的生物纳米载体（用于药物、核酸或蛋白质的特异性递送）提供了精准的蓝图。通过结构引导的修饰，有望设计出具有增强稳定性、特定表面性质（如电荷、疏水性）和定制化功能的下一代穹窿递送系统，具有重要的基础科学意义和广阔的生物医学应用前景。