《SCIENCE ADVANCES》：miRNA gene mutations commonly disrupt the proper functioning of miRNA genes
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本研究通过分析癌症基因组图谱中大量体细胞突变与对应小RNA测序数据，揭示了miRNA基因突变通过影响成熟miRNA水平、isomiR谱和链平衡等方式破坏miRNA功能的普遍现象，为理解非编码区遗传变异的致病机制提供了重要证据。
微RNA（microRNA, miRNA）作为调控基因表达的关键分子，其功能异常与多种疾病的发生发展密切相关。近年来，随着测序技术的进步，科学家们在基因组非编码区发现了越来越多的遗传变异，其中就包括位于miRNA基因内的突变。然而，一个关键的科学谜题依然悬而未决：这些发生在miRNA基因上的突变，究竟有多少是真正有害的“破坏分子”，会干扰miRNA的正常“工作”？过去的研究目光大多聚焦在直接影响miRNA“种子序列”的少数突变上，但对于散布在miRNA前体其他区域的突变，它们的影响却像一片未知的海洋，我们对其知之甚少。如果无法区分这些突变中哪些是功能性的、哪些是无关紧要的，我们就难以评估它们在疾病（如癌症）发展中的作用，也无法有效解读日益增多的基因组数据。因此，系统地评估miRNA基因突变对其功能的全面影响，成为了一个亟待解决的重要科学问题。
为了回答这个问题，一组研究人员开展了一项迄今为止规模最大、最全面的分析。他们巧妙地利用了癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas, TCGA）项目这座“数据金矿”。该数据库包含了超过10，000份癌症样本的基因组和转录组信息。研究人员从已发表的约7000个位于miRNA基因的体细胞突变清单出发，将这些突变数据与对应的、经过精准注释的小RNA测序（sRNA-seq）数据进行比对。他们设计了两种主要分析策略：第一种是直接比较同一个突变样本中，来自突变等位基因和野生型等位基因的miRNA（APPROACH_1）；第二种则是比较携带特定突变的样本与同癌症类型中未突变样本的miRNA表达情况（APPROACH_2）。通过一系列严格的筛选和分析，他们最终评估了703个突变对miRNA水平、isomiR（miRNA异构体）谱以及5p/3p链平衡的影响。此外，他们还对所有待分析的miRNA前体进行了结构建模，探究突变对结构稳定性的影响，并通过体外实验验证了部分关键突变的功能。这项研究成果发表在了国际权威期刊《SCIENCE ADVANCES》上。
研究人员开展此项研究主要运用了以下几项关键技术方法：首先，他们整合利用了癌症基因组图谱项目中超过10，000个样本的体细胞突变数据和对应的小RNA测序数据集。其次，他们使用了isoMiRmap工具对小RNA测序数据进行精准注释，以识别长度和序列变体（isomiRs）。再次，研究采用了两种核心分析策略：在同一突变样本内直接比较突变与野生型等位基因的miRNA（APPROACH_1），以及比较突变样本与同类型非突变样本的miRNA表达（APPROACH_2）。最后，研究运用了mfold和RNAComposer等生物信息学工具对所有待分析的miRNA前体进行二级和三维结构建模，以评估突变对结构稳定性的影响。
研究结果如下：
数据筛选与分析方法
为了评估miRNA基因突变对miRNA生成的影响，研究团队整合了TCGA项目中超过10，000个样本、涵盖33种癌症类型的数据。他们从一份包含7110个体细胞突变的列表出发，通过应用一系列严格的纳入/排除标准（例如排除冗余基因、长片段插入缺失等），最终确定了1309个突变用于后续分析。研究采用了两种通用方法：一是在单个突变样本内直接比较来自同一基因的突变型和野生型等位基因产生的miRNA；二是比较携带突变样本与同癌症类型非突变样本中特定miRNA的表达。整个研究的设计流程和突变筛选标准如图1所示。通过这种严谨的数据处理，确保了后续分析结果的可靠性。
通过直接比较突变样本内突变型和野生型等位基因的miRNA来分析miRNA基因突变的影响
这种方法利用了部分突变可以在RNA水平被直接观测到的特点，从而能在单个样本内无偏地比较突变型和野生型等位基因来源的miRNA。在第一个实验（Experiment_1）中，为了研究突变对miRNA水平的影响，研究者在基因组和转录组水平比较了53个符合分析标准的突变的等位基因分数。令人意外的是，DNA水平和RNA水平的突变等位基因比例之间关联甚微，且大多数突变显著偏离了代表无影响的趋势线。其中只有一个突变显著增加了miRNA水平，而绝大多数突变降低了突变等位基因的miRNA水平，在许多情况下几乎降至零。影响miRNA水平的突变大致均等地分布在成熟miRNA序列上，并未在前体的任何特定位置聚集。
在第二个实验（Experiment_2）中，为了研究突变对DROSHA/DICER1切割精度（即生成的isomiR谱）的影响，研究者比较了来自野生型和突变型等位基因的特定miRNA的isomiR谱。在测试的16个突变中，有10个显著改变了isomiR谱。例如，位于MIR342中miR-342-3p第15个核苷酸的n.75C>T突变，缩短了miRNA的3‘端，从而严重减少了经典isomiR的比例。另一个例子是位于MIR142中miR-142-3p种子序列第三位的n.55A>G突变，它使生成的isomiR的5‘端延长了1个核苷酸，显著改变了isomiR的分布。这些结果表明，许多突变能显著改变DROSHA/DICER1的切割位点，从而产生序列各异的miRNA异构体。
通过比较携带突变与不携带特定突变的样本中的miRNA来分析miRNA基因突变的影响
为了将分析扩展到位于miRNA基因其他区域（不仅仅是成熟miRNA序列）的突变，研究者采用了另一种方法，即比较携带突变的样本与同癌症类型中未携带该突变的样本之间的miRNA表达差异。
在第三个实验（Experiment_3）中，为了识别影响miRNA水平的突变，研究者比较了突变样本与非突变样本中miRNA的水平。在符合分析标准的682个突变中，有21个显著影响了miRNA水平。例如，位于MIR122 5‘侧翼区的n.5-7delAGC缺失突变导致miRNA水平显著下降，而位于MIR518E 3’侧翼区的n.85G>A突变则导致miRNA水平大幅上升。这两个突变都影响了miRNA前体的预测二维结构和稳定性，并改变了包括相关miRNA预测靶标在内的众多基因的表达。
在第四个实验（Experiment_4）中，为了研究突变对DROSHA/DICER1切割精度的影响，研究者比较了每个突变对应的isomiR谱。在420个符合条件的突变中，有32个显著影响了至少一条链的isomiR谱。例如，位于MIR142 3‘侧翼区的n.85G>A突变导致生成的miR-142-3p isomiR的5’端延长了1个核苷酸。
在第五个实验（Experiment_5）中，研究者分析了突变对miRNA链平衡的影响。在515个符合条件的突变中，有4个突变显著影响了miRNA链平衡。一个显著的例子是在胸腺瘤中发现的MIR205 3‘侧翼区的两个G碱基重复突变，该突变将miR-205-5p的主导链比例从超过99.7%大幅降低至65%，同时使miR-205-3p的比例增加超过100倍。该突变还改变了DROSHA/DICER1的主要切割位点，产生了异常的miRNA。
综合来看，在至少参与一项实验的703个突变中，研究者共鉴定出87个突变至少显著改变了miRNA加工的一个方面。值得注意的是，在纯合突变组中，功能突变的比例更高。
miRNA基因突变对miRNA前体结构的影响
虽然突变可以通过多种机制影响miRNA基因的功能，但最直接/常见的影响似乎是改变miRNA前体的结构。因此，为了初步评估突变对miRNA前体结构的影响，研究者对所有待测miRNA基因的野生型和突变型前体结构进行了建模和比较。大多数突变增加了突变型和野生型前体之间的吉布斯自由能变化值，即降低了前体结构的稳定性。功能突变的ddG值显著高于其余突变。结构分析和功能分析结果之间的关联进一步证实了所识别的功能突变的可靠性，因为这两项分析是完全独立的。
对MIR142和MIR205中突变的实验分析
为了通过实验验证miRNA基因突变的影响，研究者选择了三个MIR142突变和一个MIR205突变进行功能验证。这些突变在TCGA数据的计算分析中显示出对miRNA基因功能的显著影响。
首先，对转染了表达野生型或突变型pre-miR-142质粒的HEK293T细胞进行小RNA测序。分析显示，野生型和突变型样本之间的isomiR谱存在显著差异，所有突变表达的细胞系均一致显示出+1|n isomiR减少和0|n isomiR增加的趋势。此外，n.55A>G和n.59T>C细胞系中miR-142的相对水平显著增加，而n.85G>A细胞系中则下降。所有三个突变都使链平衡向miR-142-3p倾斜，显著降低了miR-142-5p的水平。
随后，使用双荧光素酶报告基因检测评估了突变对miRNA靶基因沉默效率的影响。结果显示，n.55A>G和n.59T>C突变降低了miR-142-3p完美匹配靶标以及天然靶标RAC1和TGFBR1的沉默效率；而n.85G>A则增强了TGFBR1靶标的沉默。
接下来，对MIR205 3‘侧翼序列中的n.97_98dupGG突变进行了双荧光素酶测试。与计算分析结果一致，该突变降低了对miR-205-5p靶标的沉默，同时增强了对miR-205-3p靶标的沉默。
研究结论与意义
这项研究是对miRNA基因突变影响的最广泛、最系统的分析。研究结果表明，大多数miRNA基因突变（不仅仅是位于种子区的突变）会影响miRNA基因的正常功能，因此在遗传分析中应被视为可能的有害变异。研究揭示了突变通过改变miRNA前体结构、影响加工酶切割精度和链选择等多种机制，广泛影响miRNA的生成和功能。值得注意的是，许多功能突变位于已知的调控基序或结构关键区域，进一步证实了miRNA前体结构和序列对精确加工的重要性。该研究还鉴定出多个位于癌症相关miRNA基因（如MIR142和MIR205）中的功能突变，为理解这些突变在癌症发展中的潜在作用提供了线索。
这项研究的发现极大地增进了我们对非编码区遗传变异如何影响miRNA生物发生和功能的理解。研究所采用的分析方法为系统评估非编码变异的功能效应提供了框架。研究结果强调了在解读基因组数据时，需要更加关注非编码区变异，特别是miRNA基因内的变异，其功能影响可能比以往认为的更为普遍和显著。这为未来开发预测miRNA基因变异致病性工具、以及深入研究特定突变在疾病（尤其是癌症）中的机制和临床意义奠定了重要的基础。
