台湾地区阿奇霉素耐药广泛耐药型鼠伤寒沙门氏菌的流行病学与基因组学研究

《Antimicrobial Agents and Chemotherapy》：Epidemiology and genomics of azithromycin-resistant extensively drug-resistant Salmonella enterica serovar Typhimurium in Taiwan

该研究揭示了台湾地区出现并增多的阿奇霉素耐药广泛耐药型(AziR-XDR)鼠伤寒沙门氏菌。研究表明，这些菌株是从已有的多重耐药(MDR)祖先菌株进化而来，通过IS26介导在IncC质粒上获得额外的耐药基因簇，从而具备了同时抵抗传统一线抗生素、氟喹诺酮类、第三代头孢菌素和阿奇霉素的能力。这项研究强调了基因组监测的重要性，以遏制此类高度耐药克隆的传播。

　　

5. 文章内容归纳总结

ABSTRACT

近期，台湾地区出现了阿奇霉素耐药广泛耐药型(AziR-XDR)鼠伤寒沙门氏菌，引起了严重的公共卫生关注。为研究其遗传基础和进化动态，研究人员分析了2007年至2024年间收集的60株分离株，包括来自人和动物的多重耐药(MDR, n = 45)株和AziR-XDR (n = 15)株。全基因组测序(WGS)分析显示，45株MDR分离株中的36株以及所有AziR-XDR分离株均属于HC50_13亚克隆（核心基因差异≤50个），并聚集在HC20_152604簇（核心基因差异≤20个）和SNP簇PDS000042202中。所有HC50_13 MDR和AziR-XDR分离株都携带位于2型IncC质粒上的核心耐药基因，包括 aac(3)-IId, aph(3'')-Ib, aph(6)-Id, bla_TEM-1, floR, sul2, tet(A)。AziR-XDR分离株还在质粒上携带了额外的抗菌素耐药基因(ARGs)，如 bla_DHA-1, dfrA17, mph(A), qnrB, 和 sul1，这些基因赋予了对阿奇霉素、甲氧苄啶、第三代头孢菌素和氟喹诺酮类的额外耐药性。属于HC50_13亚克隆的AziR-XDR鼠伤寒沙门氏菌菌株于2016年首次被鉴定，自2021年以来在台湾显著增加。该亚克隆很可能是由MDR祖先菌株通过多次IS₂₆介导的附加耐药基因盒的获得而进化而来。研究结果揭示了MDR鼠伤寒沙门氏菌如何在局部进化成高度耐药的菌株。这强调了在台湾和全球范围内进行基因组监测和协调抗菌药物管理以防止高耐药性HC20_152604分支进一步传播的必要性。

INTRODUCTION

鼠伤寒沙门氏菌是一种主要的人畜共患病原体，在世界范围内引起胃肠道和侵袭性感染。在台湾，鼠伤寒沙门氏菌一直是仅次于肠炎沙门氏菌的第二常见非伤寒沙门氏菌(NTS)血清型。令人担忧的是，与丹麦等许多西方国家相比，台湾的鼠伤寒沙门氏菌分离株显示出更高水平的抗菌素耐药性。多重耐药(MDR)菌株（定义为至少对三类不同抗菌药物耐药）在人和动物宿主中普遍存在。

由于MDR和XDR菌株的全球传播，侵袭性伤寒沙门氏菌感染的治疗变得越来越困难。随着对传统一线抗菌药物（氨苄西林、氯霉素、甲氧苄啶-磺胺甲恶唑）、氟喹诺酮类和第三代头孢菌素的耐药性出现，阿奇霉素已成为少数剩余的有效选择之一。值得注意的是，在台湾唯一报道的XDR伤寒沙门氏菌病例中，在碳青霉烯类治疗失败的情况下，阿奇霉素治疗却取得了成功。阿奇霉素越来越多地被用于治疗侵袭性NTS感染，其耐药性也在加剧。在台湾，已发现沙门氏菌含有多种阿奇霉素耐药机制。这些耐药决定因素的日益流行和多样性突显了持续监测和分子表征以指导治疗和遏制措施的迫切需要。

全基因组测序从根本上改变了细菌基因组学和临床微生物学。它能够同时进行病原体鉴定、种群结构的高分辨率分析和进化动力学分析，以及检测抗菌素耐药性和毒力决定因素。细菌监测中常规使用WGS突显了对可扩展且标准化分析方案的需求，以将测序数据转化为跨实验室和数据集的、可比较的基因型信息。核心基因组多位点序列分型方法分析WGS数据以生成标准化的等位基因谱，从而使得结果可以在不共享原始数据的情况下跨实验室进行比较。在沙门氏菌中，cgMLST的层次聚类方法进一步将分离株组织成多个遗传距离水平上的离散、嵌套的簇。每个簇分配提供了菌株之间亲缘关系的易于理解的度量，消除了常规系统发育树重建的需要。

在台湾，HierCC已被用于研究鼠伤寒沙门氏菌的长期种群变化。对2004年至2019年间收集的分离株的分析表明，大多数菌株属于七个主要的HC100克隆。其中，HC100_13尤其值得注意。它进一步分为两个HC50亚克隆，即HC50_13和HC50_6770，这两个亚克隆与不同的耐药谱和质粒类型相关。这些发现突出了HierCC在解析鼠伤寒沙门氏菌基因组种群结构方面的实用性，并为监测台湾高耐药谱系的出现提供了框架。与此同时，NCBI病原体检测系统将基因组组织成SNP簇。这些簇作为密切相关的分离株的单级分类，可用于广泛的基因组比较，但缺乏HierCC提供的层次分辨率。

2023–2024年，在台湾中南部检测到阿奇霉素耐药广泛耐药型(AziR-XDR)鼠伤寒沙门氏菌的暴发。这些菌株构成了严重的治疗挑战，因为它们对所有传统一线抗菌药物、氟喹诺酮类、第三代头孢菌素和阿奇霉素均耐药。在这项研究中，研究人员结合当地的鼠伤寒沙门氏菌种群结构，调查了AziR-XDR分离株的流行病学趋势和基因组特征。利用基于WGS的方法，重点关注耐药决定因素、其质粒骨架以及定义这一新兴高耐药分支的系统发育关系。

RESULTS

Azi-XDR鼠伤寒沙门氏菌的流行病学

HC100_13克隆是鼠伤寒沙门氏菌的主要谱系之一。总体而言，在2004年至2024年收集的所有鼠伤寒沙门氏菌分离株中，HC100_13克隆占9.0%。尽管在2014年之前很少检测到该克隆，但其在随后年份的频率大幅增加。在HC100_13簇内，出现了一个独特的亚谱系，显示出对环丙沙星的敏感性降低以及对包括氨苄西林、阿奇霉素、第三代头孢菌素（头孢噻肟和头孢他啶）、氯霉素、庆大霉素、磺胺甲恶唑、甲氧苄啶和四环素在内的多种抗菌药物类别耐药。属于该亚谱系的分离株被指定为AziR-XDR。

AziR-XDR鼠伤寒沙门氏菌菌株于2016年首次被发现，并在2023年急剧增加。这种显著增加主要是由HC100_13内AziR-XDR亚谱系的扩张驱动的。2023年，HC100_13占所有鼠伤寒沙门氏菌分离株的38.9%，其中34.8%为AziR-XDR。

基于2004年至2024年间在台湾收集的分离株，比较了七个主要鼠伤寒沙门氏菌HC100克隆的肠外感染率。卡方分析表明克隆之间存在显著差异，其中HC100_501和HC100_305的肠外感染率尤其高。HC100_13的肠外感染率为5.43%。在该克隆内，AziR-XDR与其他HC100_13分离株之间的肠外感染率没有显著差异。进一步分析也显示两组在性别分布或年龄组分布方面均无显著差异。

MDR和AziR-XDR鼠伤寒沙门氏菌菌株的基因组特征

为了研究系统发育、ARGs和相关的移动遗传元件，研究人员对45株MDR和15株AziR-XDR鼠伤寒沙门氏菌分离株进行了全基因组测序。Enterobase HierCC分配显示，这些分离株属于两个亚克隆：HC50_13和HC50_6770。这两个亚克隆表现出不同的耐药性和质粒谱。然而，在每个亚克隆内，分离株具有高度克隆性。所有HC50_13分离株属于同一个HC20簇（HC20_152604），其中47株进一步分组到HC10_152604中；而所有HC50_6770分离株则属于同一个HC10簇（HC10_32544）。NCBI病原体检测流程将所有HC50_13分离株分配到SNP簇PDS000042202，将HC50_6770分离株分配到簇PDS000042407。

这两个HC50亚克隆显示出不同的质粒谱。所有HC50_13分离株携带2型IncC质粒，而所有HC50_6770分离株则含有带有IncFIA(HI1)、IncHI1A、IncHI1B(R27)和IncQ1复制子的质粒。HC50_13分离株携带7-19个ARGs，而HC50_6770分离株携带8-12个ARGs。

完整的基因组组装和相关的ARG携带质粒

为了确定ARGs的基因组背景，研究人员使用ONT测序为25株分离株生成了完整的基因组。组装显示，ARGs位于具有不同复制子谱的质粒上。所有HC50_13分离株携带带有7-14个ARGs的2型IncC质粒。相比之下，两株HC50_6770分离株携带具有IncFIA(HI1)–IncHI1A–IncHI1B(R27)–IncQ1复制子和10个ARGs的杂合质粒。在HC50_13分离株中还发现了其他杂合质粒。IncI1-I(α)质粒与 bla_CMY-2和大环内酯类耐药基因 erm(B)和 erm(42)相关；IncFIB(pHCM2)质粒携带 dfrA51；IncN质粒携带 bla_CTX-M-65；IncB/O/K/Z质粒携带 bla_CTX-M-14和 erm(B)。

IncC质粒中的MDR基因簇

对来自MDR和AziR-XDR鼠伤寒沙门氏菌分离株的IncC质粒的比较分析确定了七个不同的MDR基因簇。携带MDR基因簇O的质粒可能代表了祖先构型，含有7个ARGs，包括 bla_TEM-1, aac(3)-IId, floR, tet(A), aph(6)-Id, aph(3'')-Ib, 和 sul2。在MDR基因簇中，大多数变异是由于在165个氨基酸的假设蛋白(HPX)旁边的IS₂₆处，通过IS₂₆介导的同源重组整合了额外的ARGs和附属基因所致，IS₂₆连接处缺乏8-bp靶位点重复序列就是证据。与MDR基因簇O相比，簇A1包含了一个插入片段，该片段包含IS₂₆, aph(3’)-Ia, sul1, aadA2, 以及几个附属基因。簇A2相对于A1携带了一个包含 bla_DHA-1, sul1和其他附属基因的附加片段。簇A3与簇A2几乎相同，但用 dfrA14替换了 aph(3’’)-Ib。簇A4相对于A2获得了一个包含三个额外ARGs（qnrB, dfrA17, 和 mph(A)）的片段。簇A5与簇A4相比，包含五个额外的 bla_DHA-1和 sul1串联拷贝，但缺乏 dfrA17和 aadA2。簇B1缺少簇A1–A4中发现的 aph(3’)-Ia–sul1–aadA2盒，但在HPX–IS₂₆位点包含了一个插入片段，该片段含有五个ARGs：dfrA17, qnrB, bla_DHA-1, sul1, 和 mph(A)。簇B1_v与簇B1具有相同的ARG组成，但包含一个额外的IS₅₀₇₅元件。

簇A4、B1和B1_v仅在AziR-XDR分离株中观察到。簇B1_v于2023年出现，随后成为主要类型，而簇A4则较少检测到。阿奇霉素耐药基因 mph(A)排列在IS₂₆-mph(A)-mrx(A)-mphR(A)-IS₆₁₀₀的遗传结构中。

IS₂₆侧翼ARG模块在质粒骨架和物种间的分布

为了检查在MDR基因簇B中发现的、携带 dfrA17, qnrB, bla_DHA-1, sul1, 和 mph(A)的IS₂₆侧翼5-ARG片段的分布情况，研究人员使用BLAST将该相应序列区域与NCBI数据库进行了比较。在排名前100的比对结果中，来自8种细菌物种的37个质粒和2条染色体携带完整的5-ARG片段。这些物种包括柠檬酸杆菌、产气肠杆菌、霍氏肠杆菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、肠沙门氏菌、福氏志贺菌和宋内志贺菌。在这37个质粒中，33个携带IncFII复制子或其变体IncFII(pRSB107)，13个是具有多个复制子的杂合质粒。剩下的四个质粒中，三个携带IncHI2–IncHI2A复制子，一个携带IncHI1A(NDM-CIT)–IncHI1B(pNDM-CIT)复制子。两条染色体也分别含有质粒复制子Col156–IncFII和IncQ1，表明5-ARG片段与IncFII质粒存在关联。此外，BLAST搜索在六个肠杆菌科物种的另外37个质粒和3条染色体中识别出一个相关的IS₂₆侧翼4-ARG片段，该片段携带四个ARGs（qnrB, bla_DHA-1, sul1, 和 mph(A)），但缺少IS₂₆-dfrA17元件。在这些质粒中，21个携带IncR复制子，12个具有IncF复制子或其变体，3个属于IncHI家族，1个是IncC质粒。携带IS₂₆侧翼5-ARG或4-ARG片段的质粒通常较大（49–368 kb），并且经常表现出多重复制子结构。总的来说，这些发现表明IS₂₆侧翼的ARG模块在肠杆菌科中广泛传播，IncFII和IncR质粒是主要的储存库。在沙门氏菌中，这些模块已在IncC、IncFII和IncHI2–IncHI2A–IncX1质粒上被鉴定。IS₂₆侧翼的5-ARG和4-ARG片段存在于多种质粒骨架中，突显了沙门氏菌可以从不同来源获取此类耐药决定因素，表明水平转移在塑造致病性沙门氏菌的抗性组方面起着关键作用。

DISCUSSION

研究结果表明，AziR-XDR鼠伤寒沙门氏菌很可能是通过2型IncC质粒上连续的IS₂₆介导的基因获取，从MDR祖先菌株在局部进化而来。AziR-XDR菌株最可能从一个携带MDR基因簇O的原型质粒进化而来，该质粒含有7个ARGs，赋予对氨苄西林、氯霉素、庆大霉素、链霉素、磺胺类和四环素的耐药性，但对甲氧苄啶不耐药。随后获得 dfrA17, bla_DHA-1, qnrB, sul1, 和 mph(A)（无论是通过逐步积累还是直接整合）赋予了对甲氧苄啶-磺胺甲恶唑、氟喹诺酮类和第三代头孢菌素的额外耐药性，同时还引入了阿奇霉素耐药性，从而满足了AziR-XDR的定义。

在临床方面，这令人担忧，因为阿奇霉素和碳青霉烯类药物仍然是治疗XDR伤寒沙门氏菌和侵袭性NTS感染的关键治疗选择。因此，AziR-XDR鼠伤寒沙门氏菌的出现和传播对患者管理构成了重大挑战。重要的是，IncC质粒是自我传播的质粒，能够在不同的变形菌门宿主之间移动ARGs。因此，其广泛的宿主范围接合转移促进了耐药性的传播，增加了沙门氏菌中AziR-XDR表型相关的公共卫生风险。

在所检查的MDR和AziR-XDR分离株中，研究人员确定了七种不同的IncC携带的ARG结构（MDR基因簇O, A1–A5, B1, 和B1_v）。携带MDR基因簇O的IncC质粒代表了祖先构型，而随后的变体通过在保守的HPX–IS₂₆位点重复的IS₂₆介导的插入、重排和缺失而进化。与BLAST调查结果一致，IS₂₆侧翼的5-ARG片段及其同源的4-ARG片段广泛存在于大型、通常为多重复制子的质粒上，主要是肠杆菌科多种物种的IncFII、IncHI和IncR质粒上，这些质粒很可能是IncC质粒从中获取这些ARG盒的储存库。这种重塑也产生了替代构型，例如MDR基因簇A5，它携带六个 sul1–bla_DHA-1盒的串联拷贝，但缺乏 dfrA17。尽管由于缺乏甲氧苄啶耐药性，A5不是AziR-XDR，但它保留了 qnrB和 mph(A)，维持了对氟喹诺酮类和阿奇霉素的耐药性。这些结果与IS₂₆的已知活性一致，包括作为假复合转座子和可移动单元组装和捕获多基因片段，以及靶向保守共整合和串联扩增，这为在观察到的IncC质粒上实现盒的获得、丢失和扩增提供了一条简约的途径。这些解释也与Allain等人的研究一致，他们证明了IncC质粒在抗生素耐药岛上经历了广泛的IS₂₆驱动的重塑，包括在保守连接处的盒插入、缺失和扩增，从而产生了多样的ARG结构。

在台湾，XDR NTS主要在鸭沙门氏菌和金黄海岸沙门氏菌中被发现。XDR鸭沙门氏菌于2015年首次被鉴定，在一个90-kb的IncC质粒上携带11个ARGs。随着这些XDR鸭沙门氏菌菌株的出现，鸭沙门氏菌分离株的比例急剧增加。XDR金黄海岸沙门氏菌于2017年首次被检测到，此后其流行率迅速增加。这些菌株通常在一个大的IncHI2质粒上携带14个ARGs，以及外排泵表达的激活因子ramAp。XDR鼠伤寒沙门氏菌菌株偶尔被观察到。属于HC50_13亚克隆的AziR-XDR鼠伤寒沙门氏菌于2016年首次被鉴定，其比例在2021年后显著增加，占2023年所有鼠伤寒沙门氏菌分离株的34.8%以及所有沙门氏菌分离株的9.3%。由于IncC质粒被充分记录为能够在不同细菌宿主之间移动ARGs的自我传播元件，鼠伤寒沙门氏菌中IncC质粒上存在AziR-XDR决定因素表明，这些菌株可能很容易通过水平转移传播耐药决定因素。

值得注意的是，在撒哈拉以南非洲地区的侵袭性鼠伤寒沙门氏菌ST313中也记录到了类似的趋势。Van Puyvelde等人报告了XDR鼠伤寒沙门氏菌ST313在多个国家的出现。此外，泛耐药(PDR)鼠伤寒沙门氏菌ST313菌株（在功能上等同于本文描述的AziR-XDR表型，因为它们仅对美罗培南敏感）在刚果民主共和国三个地理上不同的地点被独立检测到。这些XDR和PDR ST313分离株与IncHI2和IncI1质粒密切相关，而在台湾，AziR-XDR鼠伤寒沙门氏菌菌株主要在IncC质粒上携带ARGs。总的来说，这些观察结果突显出不同的质粒骨架可以介导耐药决定因素的趋同。尽管如此，公共卫生影响仍然相同：一旦建立，AziR-XDR菌株就为快速区域和区域间传播做好了准备，构成了严重的全球健康威胁。

对2012年至2024年间从人类、鸭子、猪肉和鸡肉中回收的51株HC50_13 MDR和AziR-XDR分离株的分析显示，这些菌株高度相关，全部属于HC20_152604。尽管收集时间跨度长达13年，但它们之间的基因组差异在20个核心基因之内。根据NCBI病原体检测数据库，这些分离株被分配到SNP簇PDS000042202。截至2025年8月26日，该簇包含52株分离株，其中只有一株菌株来源于2015年的加拿大安大略省，其余全部来自台湾。这些发现表明，HC20_152604(PDS000042202)分支主要在台湾传播，在那里它反复获得了额外的ARGs，最终产生了对传统一线抗菌药物、氟喹诺酮类、第三代头孢菌素和阿奇霉素耐药的AziR-XDR菌株。

先前的研究报告称，台湾人类NTS分离株的阿奇霉素耐药率从2017–2018年的3.1%增加到2021–2022年的5.9%。在美国，药敏试验数据表明耐药率在2017–2018年为0.4%，在2021–2022年为1.6%。在欧洲，2021年、2022年和2023年的耐药率分别为0.5%、0.6%和0.9%。这些发现表明，台湾NTS分离株的阿奇霉素耐药率显著高于美国和欧洲，尽管在这三个地区都观察到了上升趋势。

总之，尽管鼠伤寒沙门氏菌的HC50_13亚克隆分布广泛，但本文分析的MDR和AziR-XDR菌株属于一个独特的分支，即HC20_152604。该分支几乎只在台湾被检测到，表明其源于本地，随后在IncC质粒上通过IS₂₆介导反复获得耐药决定因素。迄今为止，没有证据表明其在台湾以外有显著的传播。对传统一线抗菌药物、氟喹诺酮类、第三代头孢菌素和阿奇霉素均耐药的AziR-XDR菌株的出现，通过使可用的治疗方案变得极少，构成了重大的临床挑战。为了遏制这一分支，持续的基因组监测、加强的抗菌药物管理以及对动物和食品储存库的监测至关重要。未来的研究应进一步调查AziR-XDR菌株的进化动力学和生态适应性，以及它们通过贸易、旅行或人畜共患传播在国际上传播的潜力。