氨基糖苷类药物增强美罗培南/伐博巴坦在中空纤维感染模型中针对KPC-producing Klebsiella pneumoniae的活性

《Antimicrobial Agents and Chemotherapy》：Aminoglycosides enhance meropenem/vaborbactam activity against KPC-producing Klebsiella pneumoniae in the hollow fiber infection model

本文在体外模型中系统评估了美罗培南/伐博巴坦（meropenem/vaborbactam）单用及联合氨基糖苷类（aminoglycoside）药物对产KPC酶肺炎克雷伯菌（KPC-Kp）的药效动力学活性。研究发现，美罗培南/伐博巴坦单药对MIC较低的菌株（≤0.25/8 mg/L）具有强大的杀菌作用，但在模拟肺上皮衬液（ELF）浓度下，对MIC接近折点（2/8 mg/L）的菌株，疗效减弱且易诱导耐药。联合氨基糖苷类（如庆大霉素或普拉佐米星）能显著增强杀菌效果，协同增效，并有效抑制美罗培南/伐博巴坦耐药性的产生。这为临床治疗中，尤其是治疗KPC-Kp肺炎（pneumonia）等难治性感染时，提供了优化联合用药方案的重要实验依据。

　　

摘要（ABSTRACT）

美罗培南/伐博巴坦是治疗产KPC肺炎克雷伯菌（KPC-Kp）感染的首选方案之一，但单药治疗的临床治愈率仍不理想。本研究旨在利用中空纤维感染模型（HFIM），评估美罗培南/伐博巴坦单用及与氨基糖苷类药物联合应用的药效动力学活性。

引言（INTRODUCTION）

碳青霉烯耐药肠杆菌（CRE）的出现对患者构成重大威胁，其中产KPC酶的肺炎克雷伯菌（KPC-Kp）被世界卫生组织列为2024年细菌优先病原体清单中的最高优先级。美罗培南/伐博巴坦等具有抗KPC酶活性的β-内酰胺/β-内酰胺酶抑制剂复方制剂是侵袭性KPC-Kp感染的首选治疗方案。伐博巴坦是一种基于硼酸的β-内酰胺酶抑制剂，对KPC酶具有强效活性。然而，在病情更严重或合并症较多的患者中，观察到更高的死亡率。此外，仅有约60%–70%的患者使用美罗培南/伐博巴坦获得临床治愈或成功。因此，危重患者等特定人群可能需要优化的治疗方案，例如联合第二种抗生素。本研究旨在表征氨基糖苷类与美罗培南/伐博巴坦联用，对具有不同美罗培南/伐博巴坦MIC的KPC-Kp分离株的药效动力学活性。

材料与方法（MATERIALS AND METHODS）

抗生素与MIC

本研究使用的抗生素包括美罗培南、伐博巴坦、美罗培南/伐博巴坦复方（Vabomere）、庆大霉素和普拉佐米星（ZEMDRI）。采用微量肉汤稀释法（BMD）重复三次测定MIC，并报告众数MIC。美罗培南/伐博巴坦MIC ≤4/8 μg/mL被定义为敏感。

突变频率测定

对16株KPC-Kp分离株进行了初始美罗培南/伐博巴坦MIC和突变频率测试。将约10⁹CFU/mL的菌液接种到含有美罗培南/伐博巴坦（8/8 mg/L）或无菌的琼脂平板上，孵育24小时后计数。突变频率通过在含药平板上的存活菌落数除以无菌平板上的菌落数来计算。

时间-杀菌曲线实验

针对具有相同MIC（2/8 mg/L）但突变频率不同的四株KPC-Kp分离株（AR-1045, AR-1049, AR-1052, AR-1054），重复进行了时间-杀菌曲线实验。测试了美罗培南/伐博巴坦在4/4、8/8、16/16和25/25 mg/L临床相关浓度下的活性。

中空纤维感染模型

在HFIM中测试了四株KPC-Kp分离株（NU-CRE105, NU-CRE244, AR-1049, AR-1054），评估美罗培南/伐博巴坦单用及与庆大霉素或普拉佐米星联合应用的药效动力学活性。实验分两个阶段：第一阶段（48小时）模拟人血浆和肺上皮衬液（ELF）中的药代动力学（PK）特征，评估针对低MIC菌株（NU-CRE105和NU-CRE244）的活性；第二阶段（168小时）模拟ELF暴露，评估针对高MIC菌株（AR-1049和AR-1054）的活性以及耐药性产生情况。杀菌活性定义为与基线（0小时）相比，细菌减少≥3 log₁₀CFU/mL。协同作用定义为与单药中活性更强的一方相比，联合用药使细菌减少≥2 log₁₀CFU/mL。

全基因组测序

对HFIM实验中168小时获得的细菌样本（AR-1049生长对照；AR-1049美罗培南/伐博巴坦组；AR-1054生长对照；AR-1054美罗培南/伐博巴坦组）进行了短读长和长读长全基因组测序，以分析耐药性产生的遗传机制。

PK验证与数据分析

使用超高效液相色谱-串联质谱法测定HFIM中央储液中的抗生素浓度，并通过非房室模型分析获得实际PK参数，与预测值进行比较。

结果（RESULTS）

较低的突变频率与美罗培南/伐博巴坦在时间-杀菌实验中更好的活性无关

在16株分离株中，有2株（12.5%；AR-1049和AR-1054）能在含美罗培南/伐博巴坦（8/8 mg/L）的琼脂上生长，其突变频率为2.65–3.19 × 10^?7，而其他14株的突变频率均<10^?9。对四株MIC均为2/8 mg/L的分离株进行的时间-杀菌实验表明，突变频率与活性或再生之间没有明显的相关性模式。尽管高突变频率菌株在8/8 mg/L药物浓度下有再生趋势，但24小时和48小时的活菌数差异并不显著。

美罗培南/伐博巴坦单用及联合氨基糖苷类药物可有效对抗低MIC的KPC-Kp菌株

在HFIM中，针对美罗培南/伐博巴坦MIC为0.125/8–0.25/8 mg/L的KPC-Kp菌株，评估了美罗培南/伐博巴坦、庆大霉素及其联合用药在模拟血浆和ELF暴露下的48小时药效动力学活性。观测到的抗生素浓度与预测的浓度曲线基本匹配。模拟血浆PK时，美罗培南/伐博巴坦对两株菌在整个实验过程中均造成稳定下降，48小时减少>5 log₁₀CFU/mL。美罗培南/伐博巴坦与庆大霉素联合显示协同作用，并在26小时前使两株菌的计数降至检测不到水平。

模拟ELF暴露时，庆大霉素的活性略有减弱，但美罗培南/伐博巴坦对NU-CRE105的杀灭作用与血浆暴露相似。然而，在对抗NU-CRE244时，使用ELF暴露的美罗培南/伐博巴坦在28至48小时期间的活性下降了2 log₁₀CFU/mL。

联合用药抑制了MIC较高KPC-Kp菌株中美罗培南/伐博巴坦耐药性的出现

在HFIM中，针对两株MIC接近敏感折点（2/8 mg/L）的菌株（AR-1049和AR-1054），在模拟ELF暴露下进行了7天的治疗测试。氨基糖苷类单药治疗未能抑制生长，并且在治疗过程中出现了耐药亚群。美罗培南/伐博巴坦单药最初对每株菌都具有杀菌作用，但随着时间的推移开始出现耐药，到168小时时，几乎整个种群都能在含美罗培南/伐博巴坦8/8 mg/L的平板上生长。重要的是，美罗培南/伐博巴坦与氨基糖苷类（庆大霉素或普拉佐米星）的联合用药能够减少细菌再生并抑制美罗培南/伐博巴坦耐药性的出现。与单用美罗培南/伐博巴坦相比，联合用药在168小时使AR-1049和AR-1054的细菌减少了7.5和4.5 log₁₀CFU/mL。

对168小时时在含药平板上生长的菌落进行BMD确认，其对美罗培南/伐博巴坦的MIC均>32/8 mg/L。全基因组测序分析显示，AR-1054耐药株（AR-1054-MV）的耐药性产生与两个亲本质粒融合形成含有两个bla_KPC基因拷贝的新质粒，以及一个IS5-like元件插入ompK36启动子上游有关。AR-1049耐药株（AR-1049-MV）的耐药机制不太明确，可能与赖氨酰-tRNA合成酶基因的3个核苷酸缺失以及赖氨酰-tRNA的复制有关，其他突变涉及营养转运蛋白、代谢酶和假定蛋白，表明耐药性可能是由整体生理转变驱动的。

讨论（DISCUSSION）

美罗培南/伐博巴坦仍然是治疗KPC-Kp感染的关键选择。然而，在危重患者等特定人群中，临床治疗失败和死亡率持续存在，这表明进一步的疗法优化可能是有益的。本研究表明，对于MIC为0.125/8至0.25/8 mg/L的菌株，模拟血浆和ELF暴露的美罗培南/伐博巴坦均表现出强大的药效动力学活性（24小时内杀菌）。相比之下，对于MIC更接近敏感折点的菌株，模拟ELF暴露的美罗培南/伐博巴坦活性较差，并且在7天的HFIM治疗中出现了耐药性。总体而言，添加氨基糖苷类药物增强了美罗培南/伐博巴坦的活性；然而，这种联用的益处对于基线美罗培南/伐博巴坦MIC较高的菌株更为明显，联合用药能够抑制耐药性的出现。

KPC-Kp中升高的美罗培南/伐博巴坦MIC通常归因于bla_KPC表达增加和外膜孔蛋白突变。尽管AR-1049和AR-1054对美罗培南/伐博巴坦敏感，但其基线MIC较高，可能与ompK35/36突变有关。

增强美罗培南/伐博巴坦抗KPC-Kp活性并降低耐药风险的一种策略是与氨基糖苷类药物联合治疗。本研究首次评估了美罗培南/伐博巴坦与氨基糖苷类药物的联用，发现该组合能够抑制美罗培南/伐博巴坦耐药性的发展。氨基糖苷类的选择基于其对每个分离株的活性。要实施类似的联合策略，需要进行表型药敏试验来选择氨基糖苷类药物。

本研究有几个关键局限性。首先，HFIM实验是单次进行的，因此无法进行统计比较。其次，联合用药中只包含了有活性的氨基糖苷类药物。第三，具有较低美罗培南/伐博巴坦MIC的KPC-Kp菌株在较短持续时间的HFIM研究中进行测试，因此不能排除再生是MIC接近折点的菌株所独有的可能性。

结论

模拟人血浆和ELF暴露的美罗培南/伐博巴坦方案在对高度敏感的KPC-Kp测试时表现出足够的药效动力学活性。然而，对于MIC为2/8 mg/L的KPC-Kp，模拟ELF暴露的美罗培南/伐博巴坦会导致耐药性出现。与氨基糖苷类药物联用能够显著增强美罗培南/伐博巴坦对所有KPC-Kp菌株的杀灭作用，并抑制耐药性的出现。这些数据表明，美罗培南/伐博巴坦通常是治疗敏感KPC-Kp的有效药物，但在单药治疗MIC接近敏感折点的KPC-Kp肺炎时可能需要谨慎。此外，本研究支持考虑将氨基糖苷类药物作为延长美罗培南/伐博巴坦在难治性KPC-Kp感染管理中效用的潜在伙伴药物。未来的临床研究需要验证这些发现。