基于家蚕感染模型的体内实验平台：定量评估抗菌药物组合对脓肿分枝杆菌的协同与拮抗作用

《Antimicrobial Agents and Chemotherapy》：Establishment of an in vivo-based assay using a silkworm infection model for phenotypic evaluation of antimicrobial drug combinations against Mycobacterium abscessus

本研究建立了一种基于家蚕感染模型的体内实验方法，用于定量评估抗菌药物组合对抗药性极强的脓肿分枝杆菌的疗效。该方法成功验证了亚胺培南与头孢西丁的体内协同作用，以及克拉霉素与阿米卡星的拮抗作用，并与体外研究结果定性一致。该平台为临床前高效、可重复、伦理负担小的药物组合表型筛选提供了有力工具。

　　

引言

由非结核分枝杆菌 (NTM) 引起的感染在全球范围内日益增多，且因这类细菌对许多常用抗菌药物具有内在耐药性而难以治疗。其中，脓肿分枝杆菌被认为是耐药性最强的物种，导致治疗选择非常有限。当前临床指南推荐长期的多药联合治疗方案。克拉霉素 (CLR) 耐药进一步限制了可用疗法，凸显了寻找可纳入联合治疗新药的必要性。因此，鉴定具有协同作用的药物组合的研究一直在进行。许多组合已在体外进行评估，部分（包括双重β-内酰胺类抗生素）也在体内进行了测试。然而，这些体内研究仅限于特定的给药条件，很少对剂量依赖性的药物相互作用进行全面评估。

尽管哺乳动物模型（如小鼠）常用于此类评估，但在这些模型中建立持续的脓肿分枝杆菌感染在技术上具有挑战性，且涉及高昂成本和伦理问题。此外，体外观察到的药物相互作用是否能在体内可靠地重现尚不清楚。因此，对能够高效、定量评估体内药物相互作用的可靠替代模型的需求日益增长。虽然体外联合试验对于分析直接的抗菌相互作用不可或缺，但它们无法捕捉宿主依赖性的治疗结果。为弥补这一局限，本研究采用了家蚕感染模型作为一个完整的生物体系统，定量评估抗菌药物组合对存活率的影响。该模型的目的是通过在一个整合的生物学背景下提供基于结果的组合效应评估，以补充体外试验，而非重现哺乳动物药代动力学。

已有研究报道了使用果蝇、斑马鱼和大蜡螟的替代脓肿分枝杆菌感染模型，但各有局限。果蝇和斑马鱼无法在37°C下维持，而大蜡螟的体型较小则阻碍了定量评估。相比之下，用于脓肿分枝杆菌感染的家蚕模型可以在37°C下维持，并能支持可重复的系统性感染，从而能够在短时间内对抗菌疗效进行定量评估。该模型允许在符合3R原则（减少、替代、优化）的前提下，对大量个体进行符合伦理的测试。此外，家蚕体重轻，可以用极少量的化合物进行评估，这使其在筛选有限或珍贵的分子方面具有优势。基于这些优势，我们选择了家蚕感染模型，并建立了一个实用的检测系统，用于对抗菌药物组合进行全面的、剂量依赖性的评估。

实验方法与结果

使用感染了脓肿分枝杆菌 JCM13569 (ATCC19977) 的家蚕模型评估了药物组合的疗效。五龄家蚕幼虫感染细菌后，在感染后30分钟内单次给予单个药物或预混合的药物组合。为了选择联合研究合适的剂量范围，我们首先确认了每种药物在单独给药时均表现出剂量依赖性的治疗效果。基于这些结果，为每种药物选择了五个剂量水平，并系统性地评估了所有可能的剂量组合。

利用生存曲线评估了延长生命的效果。结果证实，在克拉霉素与阿米卡星组合下，共同给予0.25 μg/幼虫·g的克拉霉素比单独使用阿米卡星显著缩短了生存时间。这种拮抗作用在更低的克拉霉素剂量下也被观察到。然而，当使用与单药治疗同样有效的0.5 μg/幼虫·g剂量的克拉霉素时，未观察到拮抗作用。因此，先前体外研究报告的克拉霉素与阿米卡星之间的拮抗作用在家蚕感染模型中也被观察到。相比之下，对于亚胺培南与头孢西丁组合，共同给予单独使用时无效剂量的亚胺培南和头孢西丁（分别为2 μg/幼虫·g和2或4 μg/幼虫·g）则显著延长了生存期。在其他剂量水平也观察到类似结果，该组合在体内表现出明确的协同作用。这一结果与先前在体外研究和鼠类模型中报道的协同作用一致，进一步支持了我们评估系统的有效性。该检测还在不同日期和不同给药批次中独立重复，获得了可重现的结果。

为了进一步增强该评估系统的实用性，我们建立了一个用于定量评估体内药物组合效应的指数。将所有对照组幼虫（未经药物治疗）全部死亡时的存活率可视化为热图，其中红色单元格表示达到≥80%存活率的条件，定义为80%有效剂量 (ED₈₀)。利用这个矩阵，我们计算了分数有效剂量指数 (FEDI)，其定义为每种药物在联合治疗中的ED₈₀与其作为单药治疗时的ED₈₀比值的总和。

该指数允许直观的解释：FEDI值小于0.5表示协同作用，0.5至1表示相加作用，大于2表示拮抗作用——类似于体外使用的分数抑制浓度指数 (FICI)。作为概念验证，克拉霉素与阿米卡星组合的FEDI为4.26，显示出明确的拮抗作用，而亚胺培南与头孢西丁组合的FEDI为0.31，表明强烈的协同作用。这些数值与体外FICI值（分别为2.13和0.31）有很好的对应，证实了该体内系统与已确立的体外发现具有一致性。尽管两种系统中的最佳给药比例并非完全相同，但这可能反映了体外无法捕捉的药代动力学和生理学因素。因此，定量的体内评估对于弥合这一差距并设计更具临床相关性的联合治疗方案至关重要。

讨论与结论

先前研究报道，家蚕模型获得的药代动力学参数和ED₅₀值与在哺乳动物系统中观察到的趋势具有可比性，这支持了其在哺乳动物测试前优先筛选药物组合的实际效用。家蚕感染模型的一个局限性是，实验条件下的药物暴露相对静态，不能完全重现哺乳动物的药代动力学特征，正如通常未被设计用于重现哺乳动物药代动力学的替代动物感染模型一样。在本研究中，我们的目标不是重现哺乳动物药代动力学，而是在完整的生物体感染背景下，将药物-药物相互作用作为表型治疗结果进行评估。由于单个药物及其组合是在相同的暴露条件下评估的，因此归因于药物组合的存活率相对变化可以独立于药代动力学的匹配进行定量比较。

因此，虽然家蚕模型不能重现哺乳动物药代动力学，但它可以作为抗菌药物组合表型评估的补充平台，特别是在关注相对相互作用效应而非精确药代动力学特征的背景下。

总之，我们在此开发了一种基于家蚕感染模型的体内检测系统，用于抗菌药物组合的定量评估。该平台能够以高通量和最小伦理负担的方式，对抗菌药物的协同和拮抗相互作用进行可重复的、剂量依赖性的评估。为了验证可重复性，对36种治疗条件进行了两次评估，共涉及360只家蚕。这种规模的完整生物体联合测试难以使用哺乳动物模型实现，凸显了该系统的实用价值。未来，该平台可用于在转化至哺乳动物模型之前，评估和优先筛选抗菌药物组合。

致谢

这项工作得到了日本医学研究开发机构 (AMED) 和日本学术振兴会科研费补助金的支持。资助方在研究设计、数据收集、分析、解释、报告撰写或决定提交发表方面均无作用。