微计算机断层扫描（microCT）是一种强大的三维成像技术，能够在微观到纳米尺度上表征整个生物组织。与其他成像方式相比，microCT的优势在于能够高分辨率地成像大样本[1]。它最常用于成像钙化组织，如骨骼，其中钙等重元素的X射线吸收提供了高对比度。最近，人们对使用染色技术[2]或相位对比方法[3]成像软组织产生了兴趣。虽然染色增强了对比度，但它存在局限性，包括需要较长的固定时间以及可能改变组织结构和机械性能[4]。
基于传播的（内联）相位对比成像通过利用折射率差异并通过菲涅尔条纹增强对比度，避免了染色的局限性。这种技术特别适用于在不同条件或随时间变化的离体样本成像，因为它能更接近自然状态地保持组织结构和机械性能。肌肉骨骼组织的生物力学原位microCT研究涉及对组织或整个关节施加机械负载，同时解决接近生理条件下的微观结构变化[5]。对于具有长松弛时间的软组织样本，短的扫描时间尤为重要，以最小化成像过程中的运动伪影。基于实验室的microCT系统通常受到较长扫描时间和分辨率与可用视野之间权衡的限制。相比之下，同步辐射CT（sCT）利用较大的高通量光束，能够在显著较短的扫描时间（从几秒到几分钟不等）内成像较大样本。然而，生物力学原位microCT研究的一个关键限制是需要多次扫描，这可能会使样本暴露在高水平的电离X射线辐射下。鉴于sCT成像和处理在生物力学应用中的潜力日益增长[6]，现在迫切需要共同努力减少X射线暴露并了解此类实验中辐射对生物组织的影响。
X射线辐射可以通过高能光子电离过程（如吸收和散射）导致蛋白质损伤和细胞死亡。辐射损伤的程度取决于多个因素，包括样本特性（组成、结构和环境条件）、光束属性（能量和通量）以及成像采集参数（如在光束中的时间，由投影曝光时间和投影数量决定）。Barth等人（2011年）研究了辐射剂量对皮质骨的影响，表明胶原损伤会影响多个长度尺度上的组织性能。在宏观尺度上，经过照射的样本变得脆弱，在长时间X射线照射后图像数据中可见微观裂纹。这些变化归因于胶原纤维滑动的减少以及胶原初级结构的分子损伤。Barth等人（2011年）的开创性研究确定35 kGy的剂量是一个常被引用的“安全”照射水平，该剂量不会显著损害皮质骨的机械完整性[[7],[8],[9],[10]]。
以前尝试限制X射线损伤的方法包括优化短扫描时间[11]、控制样本的水合条件[12]以及过滤X射线光束[9]。通过减少投影数量或每次投影的曝光时间来缩短扫描时间以降低剂量，在骨原位研究中得到了广泛探索，但在软组织成像中只是最近才被研究[13]。对于高对比度衰减结构（如骨骼），较短的扫描时间更容易实现。然而，通过相位对比成像解析的软组织信噪比较低，因此需要信号叠加，导致更长的曝光时间和更多的投影数量。
据认为，水分子可以保护水合样本免受直接的电离蛋白质损伤[14]。尽管如此，通过水分子的电离仍可能发生二次损伤，产生如羟基（OH）自由基等活性物质，从而损害蛋白质。降低样本温度也被研究作为一种减轻直接和二次损伤的策略[12]。此外，当使用多色光束时，过滤掉低能量光子也被用来减少其较高的吸收率所造成的潜在损伤[8,9,15]。
评估X射线损伤的方法包括对样本进行机械测试、在重复扫描中识别样本的微观结构变化[5,8]，以及使用多光子显微镜[14]、小角X射线散射或X射线衍射和拉曼光谱[16]等技术进行相关分子尺度评估。样本的机械测试表明，随着X射线暴露的增加，样本变得更硬且更脆弱[7,8,16,17]。数字体积相关性（DVC）可以测量图像体积之间的亚体素位移，并已被用于量化由于多次重复扫描导致的骨骼微观裂纹和应变的发展[5,8,17,18]。
在分子水平上，多光子显微镜揭示了胶原三螺旋结构的丧失，表现为二次谐波生成信号的减少（Sauer等人，2022年）。X射线衍射研究报道了磷灰石晶体的应变松弛[14,16]，而拉曼光谱则发现了胶原交联的增加[16]。值得注意的是，这些研究主要集中在钙化组织上，软组织中辐射诱导的损伤潜力尚未得到充分探索。
本研究旨在评估低剂量、高能量同步辐射相位对比CT用于完整椎间盘（IVDs）原位成像的可行性。我们首先专注于优化扫描参数，以实现高质量成像和短扫描时间，捕捉大尺寸离体牛样本中的软组织和钙化组织。然后，我们评估了重复扫描对即时机械性能、微观结构和分子完整性的影响。通过将成像与机械测试、数字体积相关性（DVC）、多光子显微镜和拉曼光谱相结合，我们提供了在重复同步辐射暴露下组织保存的多尺度评估。这种方法推进了sCT在负载条件下对离体IVDs进行动态成像的应用，并为研究复杂肌肉骨骼组织及其退化奠定了基础。
