通过基于氮掺杂碳点的夹心ELISA方法检测SAG1蛋白，实现急性实验性弓形虫病的早期诊断

《Acta Tropica》：Early Diagnosis of Acute Experimental Toxoplasmosis via SAG1 Detection Using Nitrogen-Doped Carbon Dot-Based Sandwich ELISA

本研究开发了一种基于氮掺杂碳点（CDNs）的夹心ELISA方法，用于早期检测急性弓形虫病。通过表达截短重组SAG1抗原免疫动物，制备抗体检测试剂，发现该方法检测下限为2.38 ng/mL，较传统ELISA灵敏度提升80%，并可在感染后第1天检测到抗原，显著改善诊断时效，适用于资源有限的高危人群。

　　

Lobna A. El-Zawawy|Mona M. El Temsahy|Nehal Nassef Hezema|Michael G. Shehat|Sherine N. Khattab|Noura M. Shebl

埃及亚历山大大学医学院医学寄生虫学系

摘要

弓形虫病由原生动物寄生虫Toxoplasma gondii引起，是免疫系统受损个体和孕妇的严重机会性感染。早期诊断至关重要，但目前的血清学检测方法往往无法区分急性和慢性感染。本研究旨在通过使用新型氮掺杂碳点（CDNs）为基础的夹心ELISA检测速殖子特异性表面抗原1（SAG1）来实现急性弓形虫病的早期诊断。截短的重组SAG1在大肠杆菌中表达，并用于免疫小鼠和兔子以产生多克隆抗体，这些抗体随后与合成的CDNs（AbCDNs）结合。对CDNs和AbCDNs结合物的光学、形态学和化学性质进行了表征。利用感染了毒力较强的T. gondii RH株的小鼠血清，评估了基于AbCDNs的ELISA的诊断性能，并将其与未结合抗体的ELISA进行了比较。结果表明，基于AbCDNs的检测方法在SAG1的检测限（2.38 ng/mL）和定量能力（7.23 ng/mL）方面显著优于未结合抗体的方法（分别为11.64 ng/mL和35.29 ng/mL）。该平台能够在感染后第一天就开始检测到循环中的SAG1，在第三天达到峰值，并持续到第七天，而传统方法仅在第三天到第七天之间能够检测到SAG1。因此，引入CDNs使诊断灵敏度从40%提高到了80%。这项研究首次应用基于AbCDNs的ELISA作为通过SAG1检测急性弓形虫病的成本效益高且可扩展的工具，从而解决了弓形虫病诊断中的关键问题，尤其是在高风险人群中。

引言

弓形虫病是一种由顶复门专性细胞内寄生虫Toxoplasma gondii引起的动物源性疾病。人类通常通过摄入含有组织囊包的未煮熟受污染的肉类或含有卵囊的食物和水而感染。（Klein等人，2020年）全球弓形虫病的患病率估计为30-50%，其中孕妇的活跃感染率在埃及、也门和沙特阿拉伯最高（Mulu Gelaw等人，2024年）。由于其严重的健康影响、全球分布以及动物源性的传播方式，弓形虫病成为一个重要的公共卫生问题。

在免疫功能正常的个体中，弓形虫病通常无症状，但在高风险群体（如孕妇和免疫系统受损的患者）中可能变得严重甚至危及生命（Liu等人，2021年）。急性弓形虫病的早期诊断至关重要，因为它可以及时进行治疗和密切监测。此外，对于排除胎儿感染的情况，还可以进行针对性的产前检测以降低风险并避免不必要的有毒药物暴露（Bobi?等人，2019年）。在免疫系统受损且有可能发生脑弓形虫病的患者中，早期发现急性或再激活的感染可以快速进行针对性治疗和优化预防措施，从而减少发病率、死亡率和长期神经系统损伤（Alves等人，2025年）。

弓形虫病传统上通过检测循环中的特异性IgM和/或升高的IgG抗体来进行血清学诊断（Mirzadeh等人，2017年）。然而，IgM可能会持续存在一年以上，而IgG通常在感染后约两周出现并可能终生存在。在免疫系统受损的患者中，抗体产生可能异常或受到抑制，这限制了血清学诊断的准确性和及时性（Chen等人，2008年）。这种方法也无法区分急性和慢性感染，并且由于与类风湿因子或抗核抗体的交叉反应容易出现假阳性结果（Selseleh等人，2012年）。另一种有前景的方法是检测血液中循环的T. gondii抗原（CAgs）以早期诊断活动性感染。据报道，CAgs可以在感染后三小时开始被检测到，在随后的3到24小时内由于宿主免疫反应和T. gondii对各种器官的侵袭而减少，然后在接下来的24到60小时内增加（Liu等人，2021年）。这可以通过多种机制解释，包括寄生虫降解、某些膜组分的脱落或快速分裂的速殖子的主动分泌（Liu等人，2021年）。表面抗原1（SAG1）蛋白是Lui等人研究中检测到的31种CAgs之一（Liu等人，2021年）。它是速殖子特异性表面抗原，是活动性T. gondii感染的关键标志物。尽管它仅占总细胞蛋白的3-5%，但它能引发强烈的IgG、IgM和IgA反应，并且与其他蛋白没有交叉反应（Wang & Yin，2014年）。SAG1基因属于SAG1相关序列（SRS）超家族，这是一组结构相关的表面蛋白，有助于寄生虫适应不同的宿主和环境（Xue等人，2020年）。值得注意的是，SAG1基因在T. gondii的不同菌株中高度保守，以单拷贝基因的形式存在于寄生虫基因组中，编码区没有内含子，大小约为1.1千碱基对（Selseleh等人，2012年）。因此，使用抗SAG1抗体通过酶联免疫吸附测定（ELISA）检测血清中的SAG1抗原有望获得良好的结果。与其他诊断方法（如分子技术）相比，ELISA在弓形虫病诊断中应用广泛，因为它提供了一种简单、定量、廉价且高通量的平台（Billingsley等人，2017年）。

从T. gondii表面抗原衍生出的重组SAG1（rSAG1）抗原是一种有价值的工具，可改善弓形虫病的血清学诊断。全长rSAG1由于蛋白质折叠不当往往具有较低的免疫原性；因此，通常使用截短形式（rtSAG1）来保留有效诊断所需的免疫原性（Li等人，2011年）。此外，选择合适的宿主对于重组蛋白的表达和折叠至关重要；因此，大肠杆菌（E. coli）是最常用的系统（Mirzadeh等人，2017年）。

纳米材料可以显著提高诊断灵敏度，其中碳量子点（CDs）作为一种有机的、环保的、无毒的、经济实惠且生物相容的荧光纳米材料脱颖而出（Zhang等人，2020年）。此外，在碳核心或表面引入杂原子或氮原子可以使它们具有多种表面功能基团，从而有助于与抗体的结合和形成强酰胺键。这可能提高传感灵敏度，因为这可以增强抗原识别和信号放大（Chahal等人，2021年）。与未掺杂的CDs相比，这还会提高光致发光性能、生物相容性和表面多样性（Demirci等人，2020年）。

本研究旨在检测感染了T. gondii RH株的小鼠血清中SAG1抗原的存在情况，感染时间不同。研究了一种基于将CDNs（作为纳米材料）与针对rtSAG1蛋白制备的多克隆抗体（pAbs）结合的方法，并使用内部开发的夹心ELISA进行比较，同时也使用了未结合的抗体。

伦理声明

所有实验程序均获得了埃及亚历山大大学医学院伦理委员会的批准，符合埃及关于实验动物的国家标准（批准编号：0201994）。所有动物实验均遵循ARRIVE指南进行（Du Sert等人，2020年）

寄生虫

使用的T. gondii毒力较强的RH HXGPRT(-)株由亚历山大大学医学院医学寄生虫学系提供

tSAG1蛋白的计算机模拟分析

Expasy ProtParam网络服务器显示，未标记的tSAG1蛋白含有259个氨基酸残基，分子量为26674.33 Da。抗原性预测得分分别为0.7623（VaxiJen；阈值0.5）和0.9517（ANTIGENpro）。此外，SOLpro服务器预测tSAG1在大肠杆菌中过表达时具有0.8830的溶解概率。使用AlphaFold生成了tSAG1、全长SAG1的3D模型及其对齐图，如图1所示。

讨论

主要的速殖子特异性表面抗原SAG1介导寄生虫的识别、附着和宿主细胞入侵，具有高度免疫原性（Hannachi等人，2019年）。其在血清中的存在反映了活动性感染，据报道在毒力较强的T. gondii菌株中的表达量是低毒力菌株的四倍（Teimouri等人，2021年）。这些特点支持了本研究选择SAG1作为准确诊断活动性弓形虫病的方法。

重组抗原

结论

本研究通过在ELISA平台上将抗rtSAG1 Ab与CDNs结合，建立了急性弓形虫病早期和敏感诊断的新方法。与传统方法相比，这种设计的内部ELISA能够更早地诊断感染，得益于CDNs较大的表面积和化学多样性。这在资源有限的环境和高风险人群中特别有价值。通过及时干预，这种方法解决了当前诊断中的关键问题。

数据可用性

支持这些发现的所有材料和数据均包含在手稿中。

资助

本研究未获得公共、商业或非营利部门的任何特定资助。

CRediT作者贡献声明

Lobna A. El-Zawawy：概念构思、方法论、监督和写作——审稿和编辑。Mona M. El Temsahy：监督、写作——审稿和编辑。Nehal Nassef Hezema：监督、方法论、写作——审稿和编辑。Michael G. Shehat：监督、方法论、资源、写作——审稿和编辑。Sherine N Khattab：方法论、写作——审稿和编辑。Noura M. Shebl：数据管理、正式分析、方法论、调查、资源、可视化、写作——

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