枯草芽孢杆菌新型AAA+ ATP酶BA PrkA在孢子形成与渗透胁迫响应中的关键调控作用及其机制研究

《Journal of Bacteriology》：A novel AAA+ ATPase required for sporulation and stress response in Bacillus anthracis

本篇研究聚焦于一种新型AAA+ ATP酶（BA PrkA）在炭疽芽孢杆菌（B. anthracis）中的作用。通过实验证明，该蛋白虽未表现出显著的蛋白酶或激酶活性，但在孢子形成（Stages II–VI）与渗透胁迫响应中发挥核心功能。BA PrkA缺失导致孢子活力严重下降、孢子形成相关基因（如cotE、sigK等）表达下调及渗透胁迫耐受性降低。机制上，BA PrkA通过与渗透胁迫响应蛋白ProA和孢子形成相关蛋白EzrA互作，揭示了其在连接胁迫适应与孢子发育间的调控枢纽角色。

　　

ABSTRACT

AAA+ 蛋白作为分子机器，利用 ATP 执行多种细胞功能，包括蛋白质稳态、应激调控和细胞周期/发育过程。本研究鉴定出一种与枯草芽孢杆菌 PrkA 具有 88% 氨基酸同源性的新型炭疽芽孢杆菌 AAA+ ATP 酶相关蛋白 BAS0518（称为 BA PrkA）。保守结构域分析表明，BA PrkA 具有一个包含特征性 Walker A 和 Walker B 基序以及保守的二级同源区（SRH）域的 N 端 AAA+ ATP 酶结构域，以及一个 C 端 cAMP 依赖性蛋白激酶结构域。基于 AlphaFold 3 预测的结构，我们将 BA PrkA 归类为 AAA+ 超家族的 Clade III。结果表明，BA PrkA 在体外条件下具有可忽略的蛋白酶和激酶活性。然而，BA PrkA 被发现在孢子形成中起着重要作用。它在孢子形成阶段 II 至 VI 期间具有时间特异性表达。BA PrkA 缺失的突变体表现出严重的孢子形成缺陷，包括孢子活力降低和与孢子包被形成相关的基因下调。这些缺陷在异位表达 BA PrkA 的互补菌株中得到逆转。此外，缺失突变株在离子渗透胁迫条件下表现出生长受损，并且当野生型炭疽芽孢杆菌暴露于 1 M NaCl 时，BA prkA 的表达被诱导了约 13 倍。对 BA PrkA 互作组（interactome）的分析揭示出两种蛋白质（ProA 和 EzrA）富集，它们分别与渗透胁迫响应和孢子形成过程有关。这些发现表明 BA PrkA 对孢子形成和渗透胁迫抵抗至关重要。

重要性： 孢子形成和胁迫适应是炭疽芽孢杆菌在恶劣环境中生存的关键。我们鉴定了一种新型 AAA+ ATP 酶，炭疽芽孢杆菌 BAS0518（BA PrkA），它与枯草芽孢杆菌 PrkA 具有 88% 的相似性。对 BA PrkA 缺失突变体的分析表明，BA PrkA 对于正确的孢子发育和胁迫适应性至关重要。BA PrkA 在孢子形成阶段 II–VI 表达，其缺失导致孢子有缺陷、活力降低、渗透胁迫耐受性下降以及关键孢子形成基因下调。互作分析确定了 ProA 和 EzrA 这两种与胁迫响应和孢子形成相关的蛋白质为潜在伙伴。这些发现确立了 BA PrkA 作为炭疽芽孢杆菌中胁迫适应与孢子形成之间调控联系的桥梁。

INTRODUCTION

芽孢杆菌属物种的生命周期包括三个相：营养生长、孢子形成和萌发。在营养生长阶段，细菌活跃生长和分裂。当生长条件变得不利时，特别是由于营养限制或环境胁迫，细菌会启动孢子形成，产生高度抵抗力的内生孢子。这些内生孢子处于代谢休眠状态，使细菌能够在不利条件下生存。一旦条件有利，内生孢子便会萌发并重新进入营养相以恢复生长和分裂。

蛋白质质量控制和稳态在营养细菌和孢子之间的转换过程中至关重要，ATP 依赖的 AAA+ 蛋白质在其中扮演关键角色。在枯草芽孢杆菌和炭疽芽孢杆菌中，Clp、Lon 和 FtsH 家族的成员代表了在胁迫响应和孢子形成等细胞过程中发挥作用的已充分表征的 AAA+ 蛋白。鉴于 AAA+ 蛋白在芽孢杆菌属中的关键作用，研究包含 AAA+ 结构域的新型蛋白质可能揭示其在炭疽芽孢杆菌中的新生理学作用。

在此，我们证明了炭疽芽孢杆菌蛋白 BAS0518（即 BA PrkA）是枯草芽孢杆菌 PrkA 的同源物，其预测的 AAA+ ATP 酶结构域在体外显示出可忽略的蛋白酶活性。这与之前报道的 BS PrkA 具有 ATP 依赖性蛋白酶活性（尽管活性很弱）形成对比。利用 BA prkA 缺失突变体，我们证明 BA PrkA 在营养阶段的正常生长中并非必需。然而，在渗透胁迫条件下，BA prkA 缺失突变体的生存受到严重损害。我们进一步揭示，当细菌在孢子形成培养基中生长时，BA PrkA 不会在活跃生长的营养细菌中产生，而仅在孢子形成的第二阶段开始出现。此外，BA prkA 缺失导致细菌生长对数期、指数晚期/稳定期早期以及稳定期晚期的 RNA 水平上多个孢子形成相关基因表达下调，包括 cotE、sigK、spoIID 和 gerE 等。

我们发现，BA PrkA 的缺失会导致形成低活力、热敏感的孢子，并且孢子的染料渗透性发生改变，这表明孢子存在结构或功能缺陷。最后，通过 BA PrkA 互作组分析，我们确定了潜在的 BA PrkA 互作伙伴 ProA 和 EzrA，它们的变化可能分别导致胁迫响应和孢子形成的缺陷。总之，这些发现表明 BA PrkA 对于有效的孢子形成和胁迫响应是必需的。

RESULTS

BA PrkA, a sequence ortholog of BS PrkA, has no detectable enzymatic activity

炭疽芽孢杆菌中的 BA PrkA 基于其与 BS PrkA 的序列相似性，被注释为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。BA PrkA 蛋白的结构域分析揭示了两个结构域的存在：一个 N 端结构域与 AAA+ 超家族相关，一个 C 端结构域与 cAMP 依赖性蛋白激酶具有远缘同源性。在蛋白质序列的 N 端部分，我们发现了保守的 Walker A 和 Walker B 基序，这是已知用于 ATP 结合和水解的 ATP 酶的特征。其他保守基序包括与结合的 ATP 的 γ-磷酸相互作用的传感器基序。蛋白质的 C 端部分包含 11 个 Hanks 型激酶典型的保守基序。有趣的是，对于 Hanks 型激酶中 ATP 结合很重要的 P 环在 BA PrkA 的 C 端部分缺失。这可能解释了为什么纯化的 BA PrkA 没有检测到自磷酸化活性。然而，BA PrkA 确实可以被另一个充分表征的炭疽芽孢杆菌 Ser/Thr/Tyr 激酶（STPK）PrkC 的催化域（PrkC^cat-GST）进行低水平磷酸化。

为了解 BA PrkA 的性质，我们首先使用 AlphaFold 3 对其单体结构进行了建模。基于此建模结构，我们随后将 BA PrkA 归类为 AAA+ 超家族 Clade III 的成员。AAA+ 蛋白超家族的 Clade III 的特征是在核心 AAA+ 结构域的 β 折叠 2（β2）和 β 折叠 3（β3）之间插入了一个孔环 1。该特征在 BA PrkA 的预测单体结构中得以识别。由于大多数 Clade III 成员形成同源六聚体复合物，我们使用 AlphaFold 3 对 BA PrkA 的同源六聚体结构进行了建模。预测结构显示 BA PrkA 的孔环 1 中存在一个保守的芳香-疏水残基对（228Y-229G），这与代表性 Clade III 结构 YME1 中观察到的情况相似。

先前一项关于枯草芽孢杆菌 BS PrkA 的研究表明其与 Lon 蛋白酶具有微弱的序列相似性，并使用 α-酪蛋白作为底物检测到了蛋白酶活性。这促使我们研究炭疽芽孢杆菌 BA PrkA 的蛋白酶活性。通过 Ni-NTA 亲和层析纯化出带有 N 端六组氨酸标签（His₆）的 BA PrkA 蛋白，在 SDS-PAGE 上呈现为单一条带，分子量约为 76.6 kDa。使用含有 5 mM CHAPS 和 1 mM TCEP 的缓冲液进一步纯化，得到了蛋白质的稳定单体形式，并通过尺寸排阻色谱耦合多角度光散射（SEC-MALS）得到确认。使用质谱进行完整质量分析显示单峰为 76,639 Da，与 His₆PrkA 蛋白的计算质量一致，证实了蛋白质纯化的有效性。

为了评估完全纯化的 His₆PrkA 的蛋白酶活性，我们使用脂多糖诱导的 TNF 因子（LITAF）和炭疽保护性抗原（PA）作为底物。纯化的单体形式 His₆PrkA 即使孵育 24 小时后也没有切割这些底物。基于 AlphaFold 3 预测和蛋白酶活性测定，我们表明 BA PrkA 在结构上类似于 AAA+ 蛋白超家族 Clade III 的成员（如酿酒酵母的 YME1 蛋白酶），但缺乏执行蛋白酶活性所需的活性位点残基。

Physiological role of BA PrkA in B. anthracisstress responses

由于炭疽芽孢杆菌在多样且恶劣的环境中生存，我们检测了 BA PrkA 在不同胁迫条件下的作用，包括离子渗透胁迫、非离子渗透胁迫和氧化胁迫。AAA+ 蛋白超家族已知在跨物种的胁迫适应机制中发挥核心作用。为了研究 BA PrkA 在炭疽芽孢杆菌中的生理功能，我们生成了一个未标记的 prkA 基因缺失突变体（BA ΔprkA）。

首先评估了 BA ΔprkA 菌株在营养丰富条件下的生长能力。在 Luria-Bertani（LB）培养基中，BA ΔprkA 表现出与野生型（BA WT）菌株相似的生长曲线，表明 BA PrkA 在正常条件下并非生长所必需。进一步探究 BA PrkA 的生理作用，我们检测了其在 LB 培养基中营养生长期间的表达情况。在 OD₆₀₀值为 3.5、6 和 8（代表生长早期、中期和晚期）收集的蛋白质样品中，在活跃生长的细胞中未检测到 BA PrkA 蛋白。转录分析同样显示，在生长早期和中期未检测到 BA prkA 表达；然而，BA prkA 转录本在生长晚期变得可检测。

接下来，使用生长测定来检查 BA PrkA 在不同胁迫条件下的作用，包括离子渗透胁迫（NaCl）、非离子渗透胁迫（20% 蔗糖）和氧化胁迫（10 mM H₂O₂）。BA ΔprkA 在 1 M NaCl 胁迫下表现出显著的生长缺陷，特别是在孵育 16 小时后。由于 BA PrkA 在生长晚期表达，并在生长的后期阶段为细胞提供保护，我们还使用刃天青进行了 16 小时生长后的终点测定。在离子渗透胁迫下，仅在 1 M NaCl 条件下观察到荧光显著降低，而在非离子或氧化胁迫条件下未检测到差异。通过菌落形成单位（CFU/mL）验证 1 M NaCl 的影响，结果显示 BA ΔprkA 相对于 BA WT 的存活率大约降低了 2.1 倍。

鉴于 BA ΔprkA 对离子渗透胁迫的敏感性，我们接下来检测了 BA prkA 转录本身是否在此类条件下被诱导。实际上，暴露于 1 M NaCl 4 小时后，BA prkA 转录水平增加了约 13 倍，这支持了 BA PrkA 在介导炭疽芽孢杆菌渗透胁迫抵抗中的作用。

BA PrkA is abundantly expressed during sporulation and is required for spore viability

先前研究表明 PrkA 在枯草芽孢杆菌的孢子形成中起重要作用。因此，我们评估了 BA PrkA 在炭疽芽孢杆菌孢子形成过程中的参与。

首先，我们在用孢子形成培养基培养的细菌中，评估了 BA PrkA 在孢子形成各个阶段（阶段 0 至 VII）的表达。BA PrkA 在孢子形成细胞中低水平存在，并从阶段 0 开始逐渐增加，直到阶段 VII（与极性隔膜形成同时发生）。BA PrkA 蛋白水平在孢子成熟后期（38 小时）下降，这表明 BA PrkA 在促进炭疽芽孢杆菌孢子形成成功完成中发挥作用。

鉴于此阶段特异性表达，我们接下来检测了其对孢子形成效率的影响。通过使用 pAMY1 质粒在 IPTG 诱导型启动子下异位表达 BA PrkA，构建了 BA ΔprkA 的互补菌株。在未加热和加热（75°C）条件下，通过量化 BA WT::pAMY1、BA ΔprkA::pAMY1 和 BA ΔprkA::pAMY1-prkA（互补）菌株的孢子计数来测量孢子形成效率。BA WT 菌株在营养饥饿 5 天后产生约 6 × 10⁶CFU/mL 的成熟（耐热）孢子。然而，BA ΔprkA 菌株的成熟（耐热）孢子数量显示出显著的 3-log 下降。这种孢子形成缺陷在互补菌株中得到挽救，证实了 BA PrkA 在孢子形成中的主要作用。

孢子形成途径在芽孢杆菌属物种中已得到充分表征，其中 sigma 因子 sigF、sigG、sigE 和 sigK 以阶段特异性方式调控孢子形成相关基因。例如，在前孢子中表达的 sigF 调控 spoIVB，而在母细胞中表达的 sigE 调控 spoVB 和 spoIID。同样，sigG（前孢子）控制 gerD，sigK（母细胞）调控 gerE。因此，我们分析了孢子形成早期和晚期关键孢子形成相关基因的表达。在孢子形成的早期阶段（阶段 0–III），我们观察到 BA ΔprkA 菌株中 cotE（4 倍）和 sigK（2.5 倍）的表达显著降低。在孢子形成阶段 V–VI，其他孢子形成基因，如 spoIID、spoIVA、spoIVB、spoVR 和 gerK 也表现出表达降低，这表明 BA PrkA 在调控孢子形成中具有多效性。基于这些基因表达分析，我们认为 BA ΔprkA 突变体产生了一种从相对早期开始并贯穿整个孢子形成过程的强烈缺陷，影响了所有被检测的孢子形成基因的表达。这种孢子形成基因的失调为在 BA ΔprkA 孢子中观察到的热敏感表型提供了机制基础。

BA PrkA is required for efficient sporulation

为了解 BA ΔprkA 为何在孢子形成中表现出缺陷，我们使用 hexidium iodide（HI）染色来追踪该菌株中孢子形成的进程和成熟孢子的生成。HI 染色 DNA 并显示其在孢子形成不同阶段的细胞分布。使用 HI 的荧光显微镜检查显示 BA ΔprkA 细胞经历了与 BA WT 相同的孢子形成阶段并形成了孢子。随后，鉴于孢子形成相关基因表达显著降低，我们研究了 BA PrkA 的缺失是否导致孢子结构缺陷。使用孢子不通透的染料 hexidium iodide 测试了 BA ΔprkA 孢子包被（包括孢子膜、孢子皮层、孢子壳和外孢子层在内的多层保护层）的完整性。来自 BA ΔprkA 菌株的未加热孢子显示出显著的孢子核心 HI 染色。这种表型在 WT 和互补菌株中不存在，表明 BA ΔprkA 菌株形成了脆弱且具有渗透性的孢子包被。因此，我们认为脆弱的孢子包被导致了 BA ΔprkA 孢子的热敏感表型。

BA PrkA interactome consists of proteins involved in septum formation, stress response, and metabolism

为了揭示 BA PrkA 影响炭疽芽孢杆菌孢子形成的机制，我们鉴定了与 BA PrkA 相互作用的蛋白质。使用在 IPTG 诱导型启动子下表达 His₆PrkA 的炭疽芽孢杆菌细胞的全细胞裂解液，进行共亲和纯化，然后进行质谱分析。细胞在生长对数早期收获，以捕获主要孢子形成特异性细胞变化发生前存在的 BA PrkA 相关蛋白质。共鉴定出 22 种共纯化蛋白质作为 BA PrkA 潜在的直接或间接互作伙伴。这些互作伙伴被分为五个主要功能类别——细胞分裂/隔膜形成、代谢过程、应激响应、基因调控和转运。

使用 ShinyGO 进行的通路富集分析将 22 种蛋白质中的 11 种映射到一个或多个功能类别。其中，ProA 和 EzrA 是最富集的蛋白质。ProA 是脯氨酸生物合成中的关键酶，先前已被证明与渗透胁迫耐受性相关。EzrA 是隔膜环形成的关键调节因子，在孢子形成过程中起关键作用。此外，另一个鉴定出的互作因子 Ppx 也与渗透胁迫响应和孢子形成效率有关。这些发现表明 BA PrkA 通过与 ProA、EzrA 和 Ppx 等关键蛋白相互作用，发挥其对孢子形成和胁迫响应的作用。这些发现突显了 BA PrkA 在协调胁迫响应、代谢适应和孢子成熟及活力所必需的细胞过程中的核心作用。

DISCUSSION

本研究鉴定了一种新型炭疽芽孢杆菌蛋白 BAS0518（BA PrkA），并揭示了其在孢子形成和胁迫适应中的功能作用。BA PrkA 包含一个推测的 N 端 AAA+ ATP 酶结构域和一个 C 端激酶结构域，与 BS PrkA 具有高度同源性（蛋白质水平 88% 相同）。我们的发现表明 BA PrkA 是一个典型的 Clade III AAA+ 蛋白，在炭疽芽孢杆菌的细胞过程中发挥调控作用。

在纯化的 BA PrkA 中未检测到激酶活性，这可能是由于其激酶结构域缺乏 P 环，这与先前报道的同源 BS PrkA 情况一致。此外，纯化的 His₆PrkA 对 LITAF 和 PA 等底物显示出可忽略的蛋白酶活性。尺寸排阻色谱耦合多角度光散射揭示了纯化 His₆PrkA 的单体形式。值得注意的是，先前在缺乏 CHAPS 和 TCEP 的缓冲液中制备的样品含有痕量水解酶污染物并具有微弱的蛋白酶活性。类似的问题可能解释了先前报道的 BS PrkA 的低水平蛋白酶活性。在还原条件下重新纯化后，BA PrkA 没有可检测的蛋白酶活性。这些发现强调了严格纯化的必要性，以避免误导性的酶活性，并表明 BA PrkA 可能通过非酶机制发挥其调控作用。

功能分析表明，炭疽芽孢杆菌中 prkA 的缺失会损害其在渗透胁迫下的生长，并改变多个关键孢子形成相关基因的转录，最终导致成熟耐热孢子形成的缺陷。尽管 BA ΔprkA 菌株在形态学上经历了与 BA WT 菌株相似的孢子形成阶段，但其孢子显示出结构和功能异常，导致热敏感性增加。基因表达分析揭示了 cotE 和 gerK 的显著下调，这两个基因分别对孢子壳形成和孢子萌发至关重要。对多个由孢子形成相关 sigma 因子（sigF、sigG、sigE 和 sigK）调控的基因的转录分析证实 BA PrkA 在孢子形成过程中具有多效性作用。在 BA ΔprkA 突变体中，其他必需孢子形成基因（如 spoIID、spoVR 和 gerK）的下调也表明 BA PrkA 对孢子形成途径具有广泛影响。在 BA ΔprkA 孢子中观察到的 altered hexidium iodide 染料渗透性，加上多个孢子形成基因的下调，表明脆弱的孢子包被可能源于孢子壳组织、核心脱水性和/或内膜完整性的综合缺陷。

为了阐明 BA PrkA 在炭疽芽孢杆菌生命周期中作用的机制基础，我们通过共亲和纯化与质谱分析绘制了其互作组。鉴定出的 BA PrkA 潜在互作伙伴蛋白质参与隔膜形成、代谢途径、胁迫响应和基因调控。值得注意的是，ProA、EzrA 和 Ppx 作为与观察到的表型相关的关键互作因子出现。ProA 是脯氨酸生物合成的核心酶，通过维持渗透平衡支持渗透胁迫适应。EzrA 是隔膜环调节因子，对细胞分裂至关重要，可能在孢子成熟和活力中具有新作用。Ppx 参与胁迫响应和孢子形成效率，进一步将 BA PrkA 与胁迫适应机制联系起来。

BA PrkA 缺乏蛋白水解活性表明其作用机制可能是作为其他 AAA+ 蛋白的竞争性抑制剂或分子支架。已知此类蛋白质通过结合底物或辅因子而不进行催化来调控过程，这种范式可能也适用于 BA PrkA。通过与 ProA、EzrA 和 Ppx 等关键蛋白相互作用，BA PrkA 可以作为一个调控枢纽，调节炭疽芽孢杆菌中的孢子形成和胁迫响应途径。

结论： 总之，本研究表明 BA PrkA 可能作为其他 AAA+ 蛋白的竞争性抑制剂或作为炭疽芽孢杆菌中的分子支架，在孢子形成和胁迫适应性中发挥关键作用。这些发现为炭疽芽孢杆菌孢子发育和胁迫响应的分子机制提供了新的见解，强调了 BA PrkA 在这些过程中的重要性。