经济简便的非专利分子检测方案开发用于无酒精啤酒中食源性病原体的快速筛查

《Journal of the American Society of Brewing Chemists》：Development of Cheap and Simple Non-Proprietary Molecular Protocol to Detect Foodborne Pathogens in Alcohol-Free Beer

这篇论文报道了一种用于检测无酒精和低酒精啤酒（NABLABs）中食源性病原体的环介导等温扩增（LAMP）检测方案。该方法具有廉价、简便、快速（<45分钟检出）且用户友好（可由酿酒师操作）的特点，成功检测了三种啤酒（拉格、淡色艾尔、世涛）中的沙门氏菌、大肠杆菌和单核细胞增生李斯特菌，为保障NABLABs食品安全提供了一种可行的现场检测工具。

　　

引言

无酒精和低酒精啤酒（NABLABs）市场正在快速增长，预计2025年全球市场规模将达到240亿美元。随着消费者对健康选择的需求增加，NABLABs应运而生。然而，啤酒中的酒精是一种重要的防腐剂，缺乏酒精使得NABLABs产品不具备与传统酒精啤酒同等的微生物稳定性。此外，根据生产方法的不同，NABLABs可能还缺乏其他抑制微生物生长的障碍（例如，存在残留糖分、较高的pH值）。此前的研究表明，沙门氏菌等病原体可以在无酒精啤酒中持续存在。随着越来越多的啤酒厂迎合对NABLAB产品的需求，在产品销售前对其进行微生物病原体筛查可能变得必要。但食品和饮料中的病原体检测需要专业且昂贵的实验室设备，这超出了许多啤酒厂的能力范围。因此，需要一种可由啤酒厂员工在没有大量设备和培训的情况下进行的、灵敏、特异且快速的病原体检测方法。

本研究旨在描述和评估一种被称为环介导等温扩增（LAMP）的、用于无酒精啤酒中病原体检测的灵敏、特异且快速的方法。LAMP是一种在等温条件（通常60–65°C）下运行、使用链置换DNA聚合酶的核酸扩增技术。它使用4到6条识别靶序列不同区域的引物，实现高度特异的扩增。反应过程中，引物产生环状结构，促进连续的链置换和指数级扩增，而无需热循环。这导致DNA快速积累，同时伴随化学变化，例如大量焦磷酸镁的积累。DNA或副产物可以通过比色指示剂进行可视化观察。LAMP因其无需昂贵设备、提供快速结果（通常<60分钟；传统培养需要数天）且可通过视觉颜色变化轻松解读（允许明确的结果）而被选中用于此项工作。

实验方法

菌株

使用的细菌菌株包括：大肠杆菌（ATCC 25922）、大肠杆菌（ATCC 35218）、大肠杆菌O157:H7（ATCC 700728）、肠沙门氏菌血清型肠炎（ATCC 13076）、纽波特沙门氏菌（ATCC 6962）、普纳沙门氏菌（NCTC 4840）、山夫登堡沙门氏菌775/W（ATCC 43845）、鼠伤寒沙门氏菌（ATCC 14028）、单核细胞增生李斯特菌（ATCC 7644）和单核细胞增生李斯特菌（ATCC 11994）。

细菌浓度测定

将细菌悬浮液用无菌盐水稀释至约10⁶CFU/mL的“加标”溶液。使用Miles和Misra方法对加标溶液中的细菌进行计数。通过比较过滤前后的计数来计算浓缩步骤的效率。

啤酒接种与DNA收集

选择了三种不同的NABLAB类型（拉格19 IBU，pH 4.2；淡色艾尔28 IBU，pH 4.5；世涛28 IBU，pH 4.1）作为模型来开发检测方案。将约10⁶CFU/mL的指定细菌（悬浮于500 μL 0.9%盐水中）添加到49.5 mL啤酒中。将样品通过装有0.22 μm或0.45 μm混合纤维素酯（MCE）膜过滤器的Swinnex过滤器支架进行过滤。过滤后，用10 mL无菌0.9%盐水冲洗过滤器以去除任何残留的可溶性物质。将滤膜转移到50 mL样品瓶中，加入2 mL无菌盐水，涡旋30秒以洗脱细胞。进行一系列十倍系列稀释，然后将每个稀释液在95°C加热20分钟以裂解细菌细胞，所得裂解液用作LAMP检测的模板DNA。

LAMP检测

使用WarmStart?比色LAMP试剂盒进行LAMP检测。每个反应混合物（25 μL）包含特定浓度的内引物（FIP和BIP）、外引物（F3和B3）以及环引物（LoopF和LoopB，如相关参考文献所述）、12.5 μL WarmStart比色LAMP 2X预混液（含UDG）、5 μL DNA模板（上一节描述的裂解液）和5 μL无核酸酶H₂O。每个细菌物种的引物信息可在在线补充表1中找到。LAMP混合物在60°C孵育30–45分钟（取决于引物组）。每次运行使用一个含有5 μL无核酸酶H₂O的反应混合物作为阴性对照。孵育后，目视检查试管并记录为阴性（粉红色）或阳性（黄色）。

数据分析

通过计数过滤前后的细菌数量来评估浓缩技术的效率。每个菌株和啤酒类型的检出限（LoD）定义为在LAMP检测中观察到明显颜色变化的最低浓度样品。这些值通过以下公式计算：LoD = （获得有效阳性结果的浓度（CFU/mL） / 50 mL） * %效率（考虑过滤效率）。

用户友好性评估

向两位当地酿酒师提供了一份详细的说明手册，该手册使用简单的语言和视觉辅助工具来描述DNA提取和样品分析方法。提供了所有实验室设备和试剂。用户每人获得五个啤酒样品（一个处理拉格，另一个处理世涛）。样品随机加标10⁴CFU/mL肠炎沙门氏菌。阳性样品和阴性样品的顺序是盲态的。

结果

病原体回收与浓缩

NABLABs中病原体的分子检测分三步进行：首先，通过过滤浓缩细菌并将其从啤酒中移除；其次，从细菌中提取DNA；最后，使用LAMP检测细菌DNA。沙门氏菌的过滤效率变化最大，范围从21%到214%（平均效率118%）。大肠杆菌的过滤效率范围从36%到161%（平均效率109%）。李斯特菌的过滤效率低于革兰氏阴性菌，除一次测量外均低于100%（范围19%至141%；平均效率55%），但仍能满足下游分析需求。

LAMP反应优化

选择了比色终点法以使结果解读尽可能简单。在此情况下，使用pH指示剂酚红使LAMP反应混合物的颜色从粉红色变为黄色，表明阳性结果。但据报道，在延长反应时间后，非模板对照管中也可能观察到“阳性”的黄色变化，这是由于引物二聚体的形成。此外，如前所述，必须为每个引物组优化LAMP检测所需的反应时间。因此，在分析样品之前，首先确定了每个引物组的最佳反应时间。为每个细菌物种选择了两个引物组进行比较。最佳反应时间定义为能够获得真正阳性结果，但非模板对照管中发生错误扩增前5分钟的时间点。

LAMP检测灵敏度

通过进行LAMP检测确定了每种目标细菌菌株在三种啤酒中的检出限。每种啤酒样品都用已知浓度的细菌加标，然后进行DNA分离方案以获得DNA模板，再通过LAMP进行分析。总体而言，与invA相比，使用ttr引物组观察到的所有沙门氏菌血清型的检出限都更低。三种啤酒类型的平均LoD，ttr为6.3 × 10²，invA为1.3 × 10³。对于非产志贺毒素的大肠杆菌菌株ATCC 35218和ATCC 25922，使用eae引物组未返回阳性结果。对于通用的大肠杆菌malB引物组，所有三个菌株都获得了阳性结果。对于致病性大肠杆菌O157:H7菌株，观察到了较低的检出限（啤酒中1.5 × 10¹–2.0 × 10²CFU/mL）。使用hly引物组检测单核细胞增生李斯特菌的检出限不如观察到的革兰氏阴性菌那么低，并且对于浓度高达3.4 × 10³CFU/mL啤酒的单核细胞增生李斯特菌ATCC 7644拉格样品未返回阳性结果。

两位没有实验室培训的酿酒师仅使用印刷版说明书就能进行操作。两位酿酒师都正确识别了他们的五个啤酒样品中哪些被随机加标了沙门氏菌（拉格的样品2和4，世涛的样品1、4和5）。阴性样品（和一个阴性对照）未变为阳性。两位用户都报告他们认为该检测方法操作简单。

讨论

本研究描述了一种用于快速检测啤酒中病原体的廉价且灵敏的检测方法。该检测无需商业平台或热循环仪即可进行，只需要恒温设备如水浴或培养箱。这意味着LAMP检测的启动成本极低。在三种不同的啤酒类型中，对三种病原体物种（沙门氏菌、大肠杆菌、单核细胞增生李斯特菌）均获得了准确结果。获得阳性结果的时间很快（30–45分钟），相比之下传统培养技术通常需要数天。LAMP检测的有效性取决于所使用的引物组。因此，为了最大限度地提高检测的灵敏度，我们为三种病原体物种分别试验了两组引物。

对于沙门氏菌的检测，之前的研究表明，基于宿主细胞侵袭基因invA和ttrRSBCA（ttr）基因位点设计的引物组在LAMP检测中高度准确，并提供最短的检测时间。使用基于invA的引物组通过LAMP检测沙门氏菌已得到充分证实；然而，有证据表明，一些血清型（肯塔基、山夫登堡和利奇菲尔德）偶尔缺乏invA序列。因此需要替代的基因靶点，其中基于ttr序列设计的引物因其遗传稳定性而特别受关注。之前的研究已证明，含有ttr引物组的LAMP反应比含有invA引物组的反应更准确（100% vs 98.7%）。本研究发现，使用ttr引物组通常观察到所有沙门氏菌血清型的检出限都更低，尽管对于纽波特沙门氏菌，invA引物组的检出限更低。这一发现进一步支持了之前的断言，即在使用LAMP检测沙门氏菌时，ttr引物比invA引物表现更好。值得注意的是，检出限最低的是肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌，这两种是人类疫情中最常观察到的血清型。

对于大肠杆菌，设计了两组不依赖志贺毒素基因位点的引物。最近的文献表明，大肠杆菌紧密素基因（eae）将提供一个合适的靶点，因为它在产志贺毒素大肠杆菌中是保守的。靶向eae的引物已广泛用于通过LAMP检测大肠杆菌，因此选择了该靶点。第二个靶点，编码麦芽蛋白的malB基因，在大肠杆菌菌株中普遍存在，因此可用于检测非产毒菌株。

为了检测李斯特菌，设计了两组引物靶向编码李斯特菌溶血素O的溶血素基因，该基因对李斯特菌的入侵和传播至关重要。先前的研究已成功使用hly引物检测食品样品中的单核细胞增生李斯特菌。在所有三种啤酒中检测李斯特菌物种的检出限与之前研究中从纯培养物获得的稀释样品使用hly1A引物发现的检出限相当。最近瑞士发生的一起与受污染面包酵母相关的李斯特菌病疫情，使得本文中单核细胞增生李斯特菌的检测尤为相关。

据研究者所知，这是首次描述使用LAMP检测啤酒中的病原体。然而，先前已有描述将LAMP检测用于啤酒中腐败微生物和酵母的检测。本工作中确定的最低平均检出限（沙门氏菌为5.4 × 10²CFU/mL，大肠杆菌为1.68 × 10²，单核细胞增生李斯特菌为6.29 × 10²）通常高于先前报道的啤酒中腐败微生物的检出限。尽管，啤酒中某些病原体血清型的个别检出限要低得多。

虽然沙门氏菌测得的平均检出限5.4 × 10²CFU/mL对于检测腐败微生物来说非常出色，但它可能仍然不够灵敏以确保食品安全。例如，一份375 mL的饮品可能仍含有高达10⁵个细胞。可以通过增加预增菌步骤（例如，将25 mL啤酒加入225 mL缓冲蛋白胨水或类似的增菌肉汤中）并在37°C孵育过夜来提高检测的灵敏度。第二天在肉汤上进行LAMP检测。虽然这会提高灵敏度，但也增加了获得结果所需的时间，并且需要更多的实验室设备和专业知识。前者可以通过仔细优化预增菌所需的时间来部分缓解。

有趣的是，一些啤酒/病原体组合显示提取效率>100%。虽然细菌在啤酒中停留的时间保持在最低限度（约30分钟），但这表明细菌在啤酒中数量有所增加。先前已描述过沙门氏菌和大肠杆菌物种在NABLAB产品中的生长，表明病原体可能在啤酒中生长了。特别是淡色艾尔似乎为细菌生长提供了有利环境，与拉格或世涛相比，普纳沙门氏菌和山夫登堡沙门氏菌的种群在淡色艾尔中翻倍。先前的研究发现，大肠杆菌和沙门氏菌能够在pH 4.6下生长，但仅限于CO₂水平降低和O₂增加的情况下。淡色艾尔是所测试的三种啤酒中pH值最高的（pH 4.5），并且在此期间是脱气且暴露于大气中的。这突显了CO₂和O₂作为啤酒保存障碍的重要性，值得进一步研究。

为确保实验方案确实用户友好，进行了一项小型试验。邀请两位当地酿酒师在一系列加标和未加标的啤酒样品上进行DNA提取和分析方法操作。仅使用说明书和提供的消耗性实验室设备，两位酿酒师都能够使用LAMP检测阳性识别出加标的啤酒样品。他们的成功证实了该方案可以轻松应用于啤酒厂环境，并且没有实验室培训的用户也可以获得可靠的结果。

总之，研究者开发了一种用于NABLABs中病原体检测的简单且用户友好的方法。目前的检出限尚不足以确保微生物食品安全，因为沙门氏菌等病原体在低感染剂量下即可致病。然而，检测的灵敏度可以通过包含预增菌步骤来提高，这是食品工业中病原体检测常用的技术。