猪源甲型流感病毒血凝素抗原位点155位氨基酸缺失对抗原性的影响及其公共卫生意义

《Journal of Virology》：Impact of an amino acid deletion detected in the hemagglutinin (HA) antigenic site of swine influenza A virus field strains on HA antigenicity

语 本研究发现，在日本猪群中分离的猪流感病毒(H1N2)血凝素(HA)蛋白抗原位点Sa存在一个罕见的155位甘氨酸缺失。研究通过反向遗传学构建重组病毒证实，该缺失对病毒在体外的复制能力影响有限，但显著改变了HA的抗原性，可能有助于病毒逃逸现有免疫。这凸显了对猪群中此类变体进行持续监测以评估其人畜共患潜力的必要性。

　　

文章内容归纳总结

引言

猪流感病毒是影响养猪业和公共卫生的重要病原体。2009年甲型H1N1流感大流行即由猪源病毒引起。血凝素是流感病毒表面的主要糖蛋白，也是宿主抗体应答的主要靶标。其中，H1亚型HA的五个结构区域（抗原位点Sa、Sb、Ca₁、Ca₂和Cb）是主要的免疫优势抗原区。此前研究表明，HA抗原位点的氨基酸替换可以改变其抗原性，特别是位于抗原位点Sa的155位氨基酸替换对抗原性有显著影响。然而，该位置发生氨基酸缺失的影响尚不清楚。

猪流感病毒分离株的遗传特征

研究从日本七个猪场分离到11株猪流感病毒，包括H1N1和H1N2两种亚型。通过全长HA和NA基因测序及系统发育分析发现，这些病毒的基因构成存在多样性。大多数内部基因片段（如PB2、PB1、PA、MP和NS）属于A(H1N1)pdm09病毒谱系，但NP基因片段在两株H1N1病毒中源自日本经典H1N2猪流感病毒。值得注意的是，一株名为A/swine/Aichi/KU-FKAB/2018 (H1N2)（简称AB株）的病毒，其HA基因源自A(H1N1)pdm09谱系，而NA基因源自日本经典H1N2谱系，显示了猪群中病毒基因重配的复杂性。

H1 HA第155位氨基酸变异分析

在对分离株进行遗传表征时，一个关键发现是AB株的HA基因在第155位存在一个甘氨酸缺失。通过分析GISAID数据库中人类、禽类和猪源甲型流感病毒H1亚型HA基因序列，发现第155位氨基酸在人类和禽类病毒中极少发生缺失（均为0%），在猪病毒中也仅占0.17%（22株）。这表明该位置的氨基酸缺失在自然界中非常罕见。

第155位氨基酸缺失对病毒复制的影响

为了评估该缺失对病毒特性的影响，研究团队基于早期的A(H1N1)pdm09分离株CA04，利用反向遗传学人工构建了四株重组病毒。这些病毒分别具有：野生型AB株的HA（CA04/HA-AB病毒）、在AB株HA第155位人工插入甘氨酸的变体（CA04/HA-ABins155G病毒）、野生型CA04株的HA（WT CA04病毒）以及在CA04株HA第155位人工删除甘氨酸的变体（CA04/HAΔ155G病毒）。

通过在高度易感的AX4细胞和人肺上皮A549细胞中测定这些病毒的体外生长动力学，结果显示，CA04/HA-AB与CA04/HA-ABins155G病毒之间，以及WT CA04与CA04/HAΔ155G病毒之间的生长曲线均无显著差异。

这些结果表明，H1 HA第155位的氨基酸缺失对病毒复制能力的影响有限，意味着这种微小的缺失有可能在猪群中自发出现，而不会严重损害病毒的复制适应性。

第155位氨基酸缺失对HA抗原性的影响

为了研究该缺失对抗原性的影响，研究使用了10株能识别A/Narita/1/2009 (H1N1)病毒（日本首株A(H1N1)pdm09分离株）HA第155位甘氨酸的单克隆抗体进行微量中和试验。结果显示，所有单克隆抗体对WT CA04病毒的中和滴度均比对CA04/HAΔ155G病毒高4至500倍。相反，所有单克隆抗体对CA04/HA-AB病毒的中和滴度均比对CA04/HA-ABins155G病毒低4至160倍。

进一步使用针对早期A(H1N1)pdm09疫苗株A/California/07/2009 (H1N1)制备的雪貂抗血清（表征流感病毒HA抗原性的金标准材料）进行评估。通常，与参考病毒株相比，测试病毒基于雪貂抗血清的中和滴度降低八倍以上即被认为存在抗原性差异。结果显示，雪貂抗血清对CA04/HAΔ155G和CA04/HA-AB病毒的中和滴度，分别比对WT CA04和CA04/HA-ABins155G病毒低8至16倍。这些数据共同表明，H1 HA第155位的氨基酸缺失显著改变了HA的抗原性。

第155位氨基酸缺失对HA构象的影响

为了评估该缺失对HA蛋白结构的潜在影响，研究使用基于深度学习的蛋白质结构预测算法AlphaFold2对四株重组病毒的HA氨基酸序列进行了三维模型预测。

预测模型表明，第155位的缺失并未引起HA蛋白显著的构象变化，提示该位置的氨基酸缺失可能构成的是H1 HA的线性表位，而非构象性表位。

讨论与结论

本研究通过对日本猪群中猪流感病毒的遗传分析，揭示了即使在同一亚型内，病毒基因构成也存在变异。重要的是，发现了一株病毒在H1 HA抗原位点Sa的第155位存在天然发生的甘氨酸缺失。尽管该缺失在自然界中非常罕见，且对病毒在细胞系中的复制能力影响有限，但它显著改变了HA的抗原性。

第155位氨基酸是H1 HA抗原位点Sa的组成部分之一。此前已知该位置的氨基酸替换会导致抗原漂移，而本研究首次证明了该位置的氨基酸缺失也对HA抗原性有巨大影响。尽管该缺失位于抗原位点Sa，但并不在由HA的130环、190螺旋和220环区域组成的经典受体结合口袋内。序列比对和结构建模表明，本研究分析的缺失155位和携带155G的HA之间，这些受体结合残基是保守的，因此该缺失不太可能直接改变受体结合特异性。

值得注意的是，在GISAID数据库中发现的22株携带此缺失的猪病毒中，有两株（包括本研究的AB株）均来自日本爱知县，且它们的HA基因具有最高的核苷酸同源性。这至少跨越两年的重复检测表明，携带此缺失HA的猪流感病毒可能是在局部地区持续循环，而非单一的偶发事件。结合其对抗原性的显著影响，这种HA缺失突变在适当条件下有可能在更大的猪群中变得更为常见。

总之，本研究揭示了H1 HA第155位微小氨基酸缺失对抗原性的显著影响，尽管其对体外复制的影响有限。这表明此类缺失突变体可以在猪群中出现并维持，并可能有助于其逃逸现有的抗体免疫。然而，该病毒在猪原代呼吸道上皮细胞中的复制能力、受体结合偏好、在动物模型中的致病性，以及其被当代人血清中和的情况仍有待评估。这些发现强调了持续对地方性循环的猪流感病毒进行遗传和抗原分析的重要性，以及未来在猪和人类系统中评估HA缺失突变的生物学和公共卫生意义的价值。