从污水处理厂分离出的多重耐药柠檬酸杆菌（Citrobacter portucalensis）KOS1-1菌株的完整基因组序列

《Microbiology Resource Announcements》：Complete genome sequence of the multidrug-resistant Citrobacter portucalensis strain KOS1-1 isolated from a wastewater treatment plant

多药耐药菌Citrobacter portucalensis KOS1-1基因组测序及耐药基因分析，分离自莫斯科污水厂处理废水，采用Illumina和Nanopore测序技术，组装出5.56 Mb基因组含1个染色体和5个质粒，鉴定出14种抗生素耐药基因，为研究废水处理系统中的耐药基因传播提供资源。

　　

摘要

多重耐药细菌的出现从流行病学和生态学的角度来看都是一个重大问题。研究这些微生物对于制定预防策略至关重要。我们报告了从莫斯科市废水样本中分离出的多重耐药菌株Citrobacter portucalensis KOS1-1的完整基因组序列。

公告

人们对来自污水处理厂（WWTP）的多重耐药（MDR）菌株的兴趣日益增加，因为它们可能是移动抗生素抗性基因（ARGs）的潜在储存库。因此，这些菌株的遗传组成和耐药基因组正受到越来越多的关注。已经从与污水处理厂相关的样本中分离出多重耐药的Citrobacter菌株，其中许多菌株能够产生碳青霉烯酶和广谱β-内酰胺酶，而这些基因通常与多种移动遗传元件相关（1）。多重耐药细菌能够在污水处理过程中存活，并通过排放物释放到环境中（2）。莫斯科的污水处理厂是世界上规模最大的污水处理厂之一，每天处理约6 × 10⁶立方米的水。处理后的废水被排放到莫斯科河中，占该河流总流量的近50%。由于这些污水处理厂的规模庞大，它们成为ARGs向环境中传播的重要来源（3）。

C. portucalensis KOS1-1菌株是通过将未经处理的原废水接种在含有四环素（20 μg/mL）、氯霉素（20 μg/mL）、卡那霉素（50 μg/mL）和氨苄西林（50 μg/mL）的LB琼脂培养基上分离得到的（4）。该菌株在含有这些抗生素的LB肉汤中于20°C下培养了2天；随后使用DNeasy PowerSoil Kit（Qiagen，德国）按照制造商的协议从50毫升培养物中提取了基因组DNA。

我们采用了结合Illumina和Oxford Nanopore平台的混合测序方法来对基因组进行测序。用于Illumina测序的文库是使用NEBNext Ultra II DNA Library prep kit（New England Biolabs，美国）制备的。在MiSeq仪器（Illumina，美国）上进行测序后，获得了741,626对读段（每个读段长度为300个核苷酸），总长度为446.45 Mb。使用FLASH v.1.2.11软件（5）和“M 300”参数合并了重叠的读段，并使用Sickle v.1.33软件（https://github.com/najoshi/sickle）以Q₃₀的质量阈值去除了低质量序列。此外，C. portucalensis KOS1-1基因组文库是使用1D Genomic DNA ligation sequencing kit SQK-LSK114从未切割的DNA中制备的，并在Oxford Nanopore公司的MinION设备上的FLO-MIN114流动池中进行了测序，共获得了17,354个读段，总长度为276 Mb。N₅₀值为23,343 bp，平均读段长度为15,880 bp。碱基调用使用Dorado v.0.9.1软件（6）和dna_r10.4.1_e8.2_400bps_sup@v5.0.0模型完成。 MinION测序数据使用Flye v. 2.9.5软件（7）和--nano-hq、--iterations 2参数进行组装。使用Pypolca v.0.3.1软件（8）将Illumina测序数据整合到组装的基因组中。组装完成的基因组大小为5,556,809 bp，包含1条染色体和5个环状质粒。基因预测使用NCBI Prokaryotic Genome Annotation Pipeline（版本2023-05-17.build6771）（9）完成。大约99%的Illumina测序数据和88%的MinION测序数据通过了质量过滤。基因组统计信息见表1。

表1

表1 基因组测序统计信息

参数	值
Illumina测序
读段数量	741,626
总碱基对数	446,458,852
Nanopore测序
读段数量	18,901
总碱基对数	298,186,162
基因组组装
总长度（bp）	5,556,809
基因组覆盖度	99.0
染色体（bp）	4,878,312
质粒pKOS1-1-1（bp）	77,569
质粒pKOS1-1-2（bp）	80,667
质粒pKOS1-1-3（bp）	110,147
质粒pKOS1-1-4（bp）	121,081
质粒pKOS1-1-5（bp）	289,033
GC含量（%）	51.69
蛋白质编码基因	5,227
tRNA基因	85
rRNA基因	25
ncRNA基因	7
假基因	178

致谢

本研究使用了“生物工程”核心研究设施（俄罗斯科学院生物技术研究中心）的科学设备，并部分得到了俄罗斯科学基金会的资助（项目编号24-74-10045，资助对象为S.B.）。