《Biochemical Society Transactions》：Emerging liquid biopsy tools to analyse cancer biomarkers: electrochemical sensors and extracellular vesicle analysis
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这篇综述系统探讨了新兴液体活检技术，特别是电化学传感器与细胞外囊泡（EV）分析领域的最新进展，旨在攻克现有技术（如ELISA）在灵敏度（-15M）、成本及便捷性上的瓶颈。文章指出，电化学传感器平台与EV作为富含多组学信息的载体相结合，有望实现高灵敏度、低成本、便携式的癌症早期检测与监测，是推动精准肿瘤学发展的重要方向。
引言
癌症的早期检测与快速诊断对于改善治疗效果和患者预后至关重要。血液作为一种微创样本来源，承载着源自全身各组织（包括癌细胞和肿瘤基质细胞）的丰富信息，为癌症生物标志物的分析提供了宝贵窗口。其中，细胞外囊泡（EV）等新兴标志物正受到越来越多的关注。
血液中的生物标志物
血液中存在多种可提供癌症线索的生物标志物类别：
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循环肿瘤细胞（CTC）：从原发肿瘤脱落后进入循环系统的癌细胞。晚期患者血液中CTC数量通常为5-10个/毫升，但在早期癌症中往往检测不到。CTC在循环中的存留时间通常较短（<1小时），且以癌细胞团簇形式存在的CTC更具转移风险。
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蛋白质生物标志物：人类血浆中含有数千种不同的蛋白质，其中如前列腺特异性抗原（PSA）和癌症抗原125（CA125）等已在临床广泛用于前列腺癌和卵巢癌的指示。然而，这些蛋白质与疾病负荷的相关性并不完美，限制了其临床可靠性。提高检测灵敏度有助于发现更多具有诊断价值的蛋白质。
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核酸生物标志物：包括循环肿瘤DNA（ctDNA）和循环细胞游离RNA（cfRNA），特别是微RNA（miRNA）。ctDNA能反映癌细胞中的突变、甲基化模式和基因组拷贝数变化。相当一部分cfDNA和cfRNA被包裹在EV中，受到保护免于降解，其中miRNA已成为有前景的生物标志物。
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细胞外囊泡（EV）：由脂质双层膜包裹的细胞物质小泡，几乎由所有细胞类型分泌。根据大小和来源，EV可分为外泌体（40-150 nm）、微囊泡（100-1000 nm）和凋亡小体。EV表面既有CD9、CD63、CD81等共有蛋白，也有如人类表皮生长因子受体2（HER2）、表皮生长因子受体（EGFR）和上皮细胞粘附分子（EpCAM）等反映其细胞起源的特异性标志物。肿瘤来源的EV在血液中非常丰富（107–109EVs/mL），远多于CTC，且其表面蛋白谱能提供关于癌症进展和转移的关键信息。
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其他循环生物标志物：包括由代谢重编程产生的“癌代谢物”（如2-羟基戊二酸）、循环肿瘤源性基质细胞以及“肿瘤教育血小板”等。
循环生物标志物的分离技术
在检测和定量之前，通常需要对分析物进行富集或分离。
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循环肿瘤细胞（CTC）的分离：技术较为成熟，包括基于EpCAM等表面标志物的亲和纯化方法，以及基于CTC通常比血细胞更大、变形性更低、密度更低的物理特性（如尺寸和变形性）的分离系统。CTC数量是多种癌症类型有价值的预后指标。
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细胞外囊泡（EV）的分离：技术多样，包括基于尺寸、电荷和亲和力的方法。超速离心是研究中常用的“金标准”大体积分离技术，但其仪器笨重、处理繁琐且需要大样本量，限制了其临床应用。其他技术如梯度超速离心、聚合物沉淀、场流分馏以及整合了抗体/适体捕获的微流体技术也得到应用。基于一种标志物（如表面蛋白）富集EV，可以结合分析EV内额外的蛋白质、核酸等，实现多参数分析。
循环生物标志物的分析技术
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核酸（cfDNA和cfRNA）的PCR与测序：分析ctDNA的常用方法包括测序（通常为靶向测序）和PCR（如等位基因特异性数字PCR）。在早期癌症患者中，ctDNA所占比例（变异等位基因分数，VAF）通常很低（<1%）。对cfRNA的分析面临不同RNA类别稳定性差异、在囊泡内的保护程度不同以及样本处理中血小板去除的变异性等挑战。
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为何需要更好的非核酸循环生物标志物分析技术？：现有技术如酶联免疫吸附试验（ELISA）的灵敏度限制在纳摩尔到皮摩尔范围，且依赖昂贵硬件、抗体和酶。临床质谱能生成丰富数据集，但受限于昂贵设备和高技能人员。过去二十年，人们加大了对成本效益高、灵敏度高、更易于直接定量的检测系统的研究。
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用于分析循环生物标志物的电化学传感器：电化学生物传感器结合了生物识别元件和物理化学传感器，可作为快速分析检测工具，用于精确检测肿瘤相关核酸、肿瘤蛋白标志物和EV。典型的生物传感器由附着在敏感传感器元件（通常由纳米材料构成）上的生物识别元件（如抗体、适体、肽）组成。当生物识别分子遇到相应的分析物时，结合事件会产生可检测的电信号。多种方法用于将生物识别元件成功附着到传感器上（生物功能化），如共价键合方法（EDC/NHS）和Au-硫醇功能化策略。纳米材料常被用作传感器元件，以放大电化学信号、增加生物分子识别元件的负载密度并增强电极/电解质界面的电荷转移速率。
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蛋白质生物标志物分析：大量概念验证研究表明，电化学传感器能够成功检测临床相关浓度范围或更低的蛋白质生物标志物。例如，前列腺癌诊断需要精确检测血浆中4-10 ng/ml的PSA，而电化学传感器已实现检测限低至10 fg/ml。目前的研究重点正转向开发用于测量一组生物标志物的多重电化学传感器。
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细胞外囊泡（EV）分析：EV蛋白分析在过去十年势头强劲。纳米粒子追踪分析（NTA）常用于EV的定量，流式细胞术可用于高通量检测EV表面蛋白，但现有硬件在检测较小囊泡（直径<500 nm）时准确性有限。质谱和Western blot需要大样本量和复杂程序。电化学检测是克服这些缺点的有前景的替代方案，有望实现对EV的高通量、经济和快速分析。研究人员通常将已建立的、用于检测可溶性蛋白质生物标志物的生物测定策略进行调整，以选择性地捕获EV并将其定位到电化学传感器平台上。大多数已报道的传感器都是在加标样本和使用培养细胞分泌的EV进行验证的概念验证演示。已有少数传感器使用临床材料进行了验证，例如用于检测卵巢癌患者血浆中EV的集成磁电化学外泌体（iMEX）平台，以及用于同时分析多个乳腺癌EV表面蛋白（如MUC1、HER2、EpCAM和CEA）的磁介导电化学适体传感器。
未来方向
尽管电化学生物传感器在超低水平检测临床重要癌症生物标志物方面表现出色，但尚未有任何获得FDA或EMA批准用于癌症临床诊断。这源于多项挑战，包括需要在复杂多样的临床样本中证明传感器的特异性，以及促进数据解读以获得临床相关性。将现有最佳生物传感器技术推向广泛的临床应用需要跨学科合作。
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改进电化学生物传感器的策略：合成生物学与人工智能（AI）
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未来的挑战包括设计适合同时、经济地对来自不同类别的多个信息标记进行定量的分析平台，并确定这种多组学分析提供的临床价值。
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合成生物学扩展了电化学传感器的机会，例如设计新型重组分析物结合蛋白。
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微流体的集成有助于控制生物界面的生成，减少交叉反应、生物污染和信号干扰。
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将人工智能（AI）和机器学习算法集成到电化学生物传感器平台，对于协助解决实时数据解读、模式识别、预测性诊断方面的数据分析问题，以及从复杂数据集中提取临床相关见解至关重要。机器学习原理正被应用于分析电化学传感器电流数据，以更准确地识别与目标配体或患者特征相关的变化。
观点
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强调该领域的重要性：新技术有潜力支持更便宜、更详细、更丰富、信息量更大且可在集中测试设施之外进行的生物标志物测量。
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当前思考总结：全球癌症发病率正在上升，许多新疗法必须与特定的患者群体相匹配。因此，需要更好的微创癌症分析来实现有效且负担得起的癌症诊断、治疗和监测。
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对未来方向的评论：通过应用合成生物学和量子技术，可以提高生物标志物检测的灵敏度和选择性。相关地，机器学习和人工智能的改进允许在复杂多样的数据集中识别疾病相关模式，正被用于许多生物标志物分析技术中。
