《Biochemistry and Biophysics Reports》：Immunoinformatic-driven design of a multi-epitope vaccine against
Helicobacter
pylori
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为应对全球约半数人口感染且被明确归为I类致癌原的幽门螺杆菌（Helicobacter pylori， H. pylori），伊朗研究团队基于免疫信息学方法设计了一种新型多表位疫苗。该研究通过分析病原体基因组筛选出T细胞与B细胞高潜力表位，成功构建了候选疫苗，并系统评估了其抗原性、理化性质及结构稳定性。分子对接与动力学模拟证实该疫苗可与关键免疫受体TLR2/TLR4稳定互作，体外免疫模拟预测其能有效激发体液与细胞免疫应答。此项工作为开发安全、稳定且高效的抗H. pylori疫苗提供了重要的计算机辅助设计与理论依据。
在全球范围内，大约每两个人中就有一人的胃黏膜中潜藏着一种名为幽门螺杆菌（Helicobacter pylori， 简称H. pylori）的微生物。这种革兰氏阴性细菌不仅是慢性胃炎、消化性溃疡的常见元凶，更被世界卫生组织下属的国际癌症研究机构明确定义为I类致癌物，与胃癌的发生发展密切相关。尽管感染H. pylori的人口基数庞大，且长期抗生素疗法存在耐药性、复发及破坏肠道菌群平衡等诸多弊端，但时至今日，市场上仍未有一款获批上市的H. pylori疫苗。这种“有菌无苗”的困境，使得开发一种安全、有效的预防性疫苗成为全球公共卫生领域的迫切需求。传统的全菌灭活或减毒活疫苗策略在安全性和有效性上面临挑战，而随着生物信息学技术的飞速发展，基于基因组数据的“反向疫苗学”与“免疫信息学”方法为疫苗设计开辟了新路径。这类方法能够精准、高效地从海量病原体蛋白中筛选出最具潜力的免疫靶点——即能被免疫系统（特别是B细胞和T细胞）识别的特定片段（表位），从而设计出针对性强、安全性高的多表位疫苗。近期，一项发表在《Biochemistry and Biophysics Reports》上的研究，正是利用这一前沿策略，为我们呈现了一种针对H. pylori的创新型多表位疫苗的设计蓝图与计算机模拟验证。
为了构建并评估这款候选疫苗，研究人员采用了一套系统化的免疫信息学与计算生物学工作流程。首先，从NCBI数据库获取H. pylori的全基因组序列，利用ORF Finder工具预测所有可能的开放阅读框（ORF），并通过PSORTb、SignalP、TMHMM等工具筛选位于细胞外或外膜、无信号肽和跨膜结构域的蛋白作为初始候选靶点。接着，运用VaxiJen、AllerTOP、ToxinPred等服务器评估候选蛋白的抗原性、过敏原性和毒性。关键的免疫表位预测环节，研究者借助免疫表位数据库与分析资源（IEDB）分别预测了线性B细胞表位、主要组织相容性复合体I类（MHC-I）和II类（MHC-II）结合表位，并综合考虑了其IEDB结合分数、抗原性评分及安全性。随后，将筛选出的最优表位（两个MHC-I表位、两个MHC-II表位和三个B细胞表位）通过特定连接肽（AAY、GPGPG、KK）串联，并在N端通过刚性连接肽EAAAK融合了来自霍乱毒素的B亚单位（CTxB）作为佐剂以增强免疫反应，同时在C端添加了组氨酸标签（His-tag）以便于纯化。对最终构建的疫苗蛋白，研究人员进一步使用ProtParam分析其理化性质，使用GOR IV算法预测二级结构，并利用I-TASSER和Robetta服务器预测及优化其三级结构，通过PROCHECK、ERRAT、ProSA-web和MolProbity等工具对模型进行质量验证。为了评估疫苗与宿主免疫系统的潜在相互作用，研究进行了分子对接分析（使用ClusPro 2.0和HADDOCK服务器），模拟疫苗与关键天然免疫受体Toll样受体2（TLR2）和Toll样受体4（TLR4）的结合。此后，利用GROMACS软件进行了为期150纳秒的分子动力学（MD）模拟，通过分析均方根偏差（RMSD）、均方根涨落（RMSF）、回转半径（Rg）和氢键数量等指标，评估了疫苗自身及其与受体复合物的结构稳定性与动态行为。此外，还通过HawkDock平台结合MM/GBSA（分子力学/广义波恩表面积）方法计算了结合自由能，并使用C-ImmSim服务器进行了计算机免疫模拟，以预测疫苗可能引发的免疫反应动态。最后，为了便于未来的实验研究，对疫苗的核苷酸序列进行了密码子优化（使用JCat工具）以适应在大肠杆菌（Escherichia coli）中表达，并利用SnapGene软件进行了体外克隆模拟，将其插入pET-28a(+)表达载体。
研究结果
3.1. 幽门螺杆菌序列检索与靶点筛选
通过对H. pylori全基因组的分析，最初预测出8209个ORF。经过亚细胞定位、信号肽和跨膜结构域筛选后，重点关注位于细胞外或外膜的蛋白。其中，ORF15（编码鞭毛蛋白B， Flagellin B）因其较高的抗原性评分（0.7911）、非毒性及非过敏原性而被选为进一步筛选B细胞、MHC-I和MHC-II表位的核心靶蛋白。
3.2. B细胞表位预测
使用IEDB服务器从Flagellin B蛋白中预测出多个线性B细胞表位，最终根据评分和结构筛选出三个表位（NNISVTQVNVKAAESQIRDVDF， KAMDEQIK， QNNRDLSSSLEKLSSGLRINKAAD）。这些表位经VaxiJen、ToxinPred和AllerTOP评估，均显示具有良好的抗原性（得分分别为1.393、1.2589、0.6929），且无毒、非过敏。
3.3. MHC-I限制性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）表位预测
利用IEDB服务器针对所有人HLA等位基因预测MHC-I结合表位，根据IEDB评分与抗原性评分的平均值，最终选出两个最优表位（EASMDIQGR和KLSSGLRINK）。它们与特定HLA等位基因（如HLA-A68:01和HLA-A03:01）具有高结合亲和力，且被预测为无毒、非过敏。
3.4. MHC-II结合表位预测
同样使用IEDB服务器预测MHC-II结合表位，根据平均评分筛选出两个表位（NANGAQAETNSQGI和FRINTNIAALTSHAVGVQ），它们与特定HLA-DQ和HLA-DR等位基因结合良好，且安全性评估通过。
3.5. 强效疫苗候选物的设计与组装
将上述筛选出的两个MHC-I表位、两个MHC-II表位和三个B细胞表位，分别通过AAY、GPGPG和KK连接肽串联起来。在N端，通过EAAAK连接肽融合了CTxB佐剂，在C端添加了His-tag，从而构建出完整的多表位疫苗序列。该设计通过SnapGene软件进行了可视化展示。
3.6. 疫苗蛋白的抗原性、过敏原性、溶解性和毒性预测
对设计的疫苗蛋白进行评估：VaxiJen v2.0服务器显示其抗原性得分为0.8561，表明具有强免疫原性潜力；AllerTOP v.2服务器预测其为非过敏原；ToxinPred2服务器确认其无毒性；Protein-Sol服务器预测其溶解性良好，得分为0.632。
3.7. 理化性质分析
使用ProtParam服务器分析显示，该疫苗蛋白由259个氨基酸组成，分子量为28382.35 Da，理论等电点（pI）为9.63。不稳定指数为27.02（<40），预测其在体内稳定。脂肪族指数为80.73，表明具有较好的热稳定性。总平均亲水性（GRAVY）为-0.435，表明蛋白呈亲水性。
3.8. 疫苗构建体的二级和三级结构预测
二级结构预测显示，该蛋白含有43.63%的α-螺旋、15.06%的延伸链和41.31%的无规卷曲。利用I-TASSER和Robetta服务器预测了三级结构，并通过多种工具验证。最佳模型的Ramachandran图显示99.60%的残基位于优势区和允许区，ERRAT评分为99.19%，ProSA-web的Z得分为-5.80，MolProbity分析也显示结构质量很高，表明预测的三级结构可靠。
3.9. 分子对接
为了评估疫苗与免疫系统的相互作用，使用ClusPro 2.0和HADDOCK服务器将疫苗与TLR2（PDB ID： 5d3i）和TLR4（PDB ID： 7mlm）进行分子对接。结果显示，疫苗与两种受体都能稳定结合，其中与TLR4的结合似乎更强（ClusPro加权得分：疫苗-TLR2为-1561.2， 疫苗-TLR4为-922.5；结合自由能ΔG计算也显示疫苗-TLR4复合物结合更紧密）。PRODIGY服务器计算的解离常数（Kd）值极低，进一步证实了结合的高亲和力。关键结合残基涉及TLR2的Ile319、Phe322、Tyr326等，以及TLR4的Arg380、Lys341、Gln339等。
3.10. 分子动力学模拟
为了在更接近生理环境的动态条件下评估稳定性，对疫苗自身、TLR2/TLR4受体以及它们的复合物进行了150纳秒的分子动力学模拟。分析均方根偏差（RMSD）和回转半径（Rg）发现，所有体系在模拟过程中均保持稳定，波动较小。均方根涨落（RMSF）分析显示，疫苗与TLR4结合后，结合界面区域的波动显著降低，表明形成了非常稳定的复合物；与TLR2的复合物也显示出可接受的稳定性。氢键分析表明，疫苗-TLR4复合物在整个模拟过程中平均维持约13.88个氢键，多于疫苗-TLR2复合物的约11.15个，提示与TLR4的相互作用网络更紧密。
3.11. 结合自由能计算
利用MM/GBSA方法计算疫苗与TLR2和TLR4的结合自由能。结果显示，疫苗-TLR4复合物的总结合能（-179.46 kJ/mol）比疫苗-TLR2复合物（-65.18 kJ/mol）更负，表明疫苗与TLR4的结合亲和力更强，这与分子对接和动力学模拟的结果一致。范德华力、静电相互作用和溶剂可及表面积（SASA）能量对结合有利，而吉布斯（Gibbs）能量起到不利作用。
3.12. 免疫模拟
使用C-ImmSim服务器模拟疫苗接种后的免疫反应。模拟结果显示，在三次剂量接种后，疫苗能够诱导强烈的免疫应答：免疫球蛋白M（IgM）水平在初次应答中升高，随后免疫球蛋白G（IgG1和IgG2）水平显著上升，表明产生了强烈的体液免疫。B细胞和辅助性T细胞（TH）群体扩增。此外，干扰素-γ（IFN-γ）等细胞因子分泌增加，提示疫苗也能激发细胞免疫应答。记忆B细胞和记忆T细胞水平也维持在较高水平，预示着可能产生长效免疫保护。
3.13. 密码子优化与体外克隆
为使疫苗能在E. coli中高效表达，使用JCat工具对疫苗的核苷酸序列进行了密码子优化。优化后的序列长度为891个核苷酸，密码子适应指数（CAI）为1.0，GC含量为47.74%。将优化后的序列克隆到pET-28a(+)表达载体中，经NcoI和XhoI双酶切验证，成功获得包含疫苗片段（785 bp）和载体骨架（5231 bp）的重组质粒。
结论与讨论
本研究通过系统性的免疫信息学与计算生物学方法，成功设计并计算机模拟验证了一种针对H. pylori的新型多表位疫苗候选物。该疫苗以鞭毛蛋白B（Flagellin B）为靶点，整合了筛选出的高评分、高安全性B细胞、MHC-I和MHC-II表位，并通过优化连接肽与CTxB佐剂融合，旨在同时激发强大的体液免疫和细胞免疫。全面的计算机分析表明，该疫苗构建体具有高抗原性、非过敏原性、无毒、良好的溶解性和理想的理化性质（如低不稳定指数、亲水性）。其预测的三维结构质量可靠。更重要的是，分子对接与长达150纳秒的分子动力学模拟证实，该疫苗能够与宿主天然免疫的关键受体TLR2和TLR4形成稳定且高亲和力的复合物，尤其与TLR4的相互作用更为突出。计算机免疫模拟进一步预测该疫苗能有效诱导抗体产生、T细胞活化及细胞因子释放，并可能形成免疫记忆。
该研究的讨论部分强调了H. pylori感染的全球负担及其与胃癌的明确关联，指出当前抗生素疗法的局限性，从而凸显了开发有效疫苗的紧迫性。研究团队采用的“反向疫苗学”和“多表位疫苗”策略，代表了现代疫苗设计的前沿方向，能够提高疫苗的安全性和靶向性。选择Flagellin B作为核心抗原，是因为其在H. pylori的 motility（运动）、定植和免疫逃避中起关键作用，且本研究证实其具有高抗原性和安全性。研究中使用的特定连接肽（如AAY、GPGPG、KK、EAAAK）旨在优化表位的加工、呈递，并维持各功能域的独立性。与TLR2/4的强相互作用预测，为疫苗通过激活天然免疫通路来启动适应性免疫提供了理论基础。
总之，这项计算机模拟研究为开发抗H. pylori感染的新型疫苗提供了有前途的候选设计和坚实的理论预测。所有计算机分析结果均提示该疫苗构建体安全、稳定且具有高度免疫原性潜力。当然，作者也明确指出，这些积极的计算机预测结果仍需通过后续的体外实验、动物模型研究和临床试验来最终验证其实际的有效性与安全性。这项工作不仅为对抗H. pylori这一重大公共卫生威胁提供了新的解决方案思路，也展示了免疫信息学在加速和优化疫苗研发过程中的强大能力。
