《Biochemistry and Biophysics Reports》：Enhancement of prime editing by recruiting engineered or evolved components and implementing novel strategies
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这篇综述全面梳理了prime editing（PE）技术的最新进展，指出了其在基因治疗领域的巨大潜力，但也坦诚其效率等局限性。文章的核心在于系统地总结和比较了两种核心优化路径：一是通过理性设计或定向进化对编辑器蛋白（PE）和引导RNA（PegRNA）进行工程化改造（如PE6变体系列、PEmax、epegRNA等）；二是开发创新的编辑策略（如PE3/4/5、Twin-PE、PASTE等）来克服细胞内的竞争机制（如MMR系统、P53通路）和递送瓶颈。作者强调，pegRNA的精密设计是关键，而结合增强型组件与优化策略是迈向高效、精准体内基因编辑的未来方向。
1. 引言
CRISPR系统作为细菌的适应性免疫系统，现已成为广泛使用的基因组编辑工具。其核心由Cas核酸酶蛋白和单链引导RNA（sgRNA）组成。Prime Editing是一种基于CRISPR的精确基因编辑策略，它使用由切口酶SpCas9（nSpCas9）和莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶（MMLV-RT）组成的嵌合蛋白（称为PE1或改进后的PE2）。该系统由一种扩展形式的sgRNA，即prime editing guide RNA（PegRNA）引导，该RNA携带了要应用到靶序列的预期编辑。
Prime Editing具有多重优势：它不产生DNA双链断裂（DSB），降低了产生非预期插入/缺失（indel）的风险；编辑范围广，可校正几乎所有类型的点突变、插入和缺失；且在不分裂细胞中同样有效。然而，其编辑效率相对较低，插入/缺失大小有限，且编辑结果并非总是完全精确。
2. 改进的prime editing策略
为克服低效率问题，研究者开发了多种策略。PE3策略使用第二个sgRNA在对侧链上引入额外的切口，以利于错配修复（MMR）系统将编辑后的链选作模板，可将效率提升高达4.2倍，但可能增加indel和脱靶风险。PE4和PE5策略则通过使用显性失活MLH1（MLH1dn）暂时抑制MMR系统活性，并结合第二个切口引导RNA（ngRNA），平均可将编辑效果提升2倍。最近，一种AI生成的MLH1小结合蛋白（MLH1-SB）被证明抑制效果更佳。此外，Cas9-DNA结合触发的P53依赖性细胞周期阻滞也会负面影响编辑效率，共表达小鼠显性负性P53（mP53DD）可在大约2倍程度上提升效率，但存在致癌风险。
另一种策略PEn使用具有核酸酶活性的野生型Cas9与PegRNA结合，本质上是prime editing与同源重组（HR）的结合，可实现高效率编辑，但会产生高频率的非预期靶向indel。使用NHEJ抑制剂如i53可部分缓解此问题。
3. 其他prime editor变体（非SpCas9 PEs）扩大编辑范围
除了基于nSpCas9的PE，其他Cas蛋白也被用于扩展PAM识别范围。例如，使用LbCas12a切口酶（nCas12a）的CPE（circular prime editing）系统，采用分裂的pegRNA和环状PBS-RTT RNA模板，可用于多重基因编辑。nSaCas9及其变体（如SaCas9 KKH）也被用于构建PE，以识别不同的PAM序列（如NNNGRRT或NNNRRT），尽管其效率通常低于基于nSpCas9的PE。
4. 具有改进编辑活性的增强型突变prime editor
通过理性设计和定向进化，研究者开发了多种增强型PE蛋白变体。PEmax是首个工程化的PE2变体，包含人源密码子优化的RT、优化的核定位信号以及nSpCas9中的两个点突变（R221K和N394K），其效率比PE2高约2.8倍。针对非分裂细胞中dNTP浓度低的问题，研究者设计了MMLV-RT的YMDD突变（PEmax**，含L435K和V223M突变）以增加对dNTP的亲和力及蛋白溶解性。抑制dNTP调节蛋白SAMHD1（如使用HIV-2的VPX蛋白）也能提升非分裂细胞中的编辑效率。
定向进化方法，如噬菌体辅助进化，产生了PE6变体系列（PE6a-d），它们使用进化或工程化-进化后的非MMLV来源RT（如evo-Ec48、eng-evo-Tf1、eng-evo-MMLV-RT）。这些变体在不同场景下各具优势：PE6a尺寸最小；PE6b适合短且非结构化的RTT；PE6c和PE6d则更适合长而结构化的RTT或成对pegRNA策略。酵母定向进化系统OrthoRep则产生了PE-Y18变体，其在体内外均显示出超越PEmax的活性。
其他增强方法包括：在PE中融合Rad51单链DNA结合域（ssDBD）以稳定DNA-RNA杂交体（hyPE2）；融合筛选出的肽段（如IN-PE2）以增强Cas9与核酸的相互作用；在PE C端连接截短的La蛋白以保护pegRNA的3’末端免受核酸外切酶降解（PE7）。
5. 改善染色质可及性以提高prime editing效率
染色质可及性是影响CRISPR/Cas9编辑效率的关键因素。通过将转录因子（如P65，通过Suntag系统引导）或染色质调控肽段（如HN1和H1G，构成CMP-PE-V1）募集至靶位点，可以松散染色质结构，从而提升PE对DNA的访问效率，进而提高编辑效率。
6. 提高prime editing效能的工程化pegRNA
细胞内的3’核酸外切酶会降解pegRNA，降低其完整性。工程化pegRNA（epegRNA）通过在pegRNA的3’端添加tevopreQ1或mpknot等RNA基序来保护PBS和RTT序列，可将编辑效率提升3-4倍。其他保护性结构还包括Zika病毒外切核糖核酸酶抗性基序（Xr-PegRNA）和G-四链体结构（G-PE）。
pegRNA的潜在环化也会影响效率。ePE和tPE（tethered PE）方法通过不同机制（如添加Csy4可切割位点或将pegRNA与PE-MCP杂交蛋白拴系）来抑制环化。分裂PE（sPE）则使用分裂的pegRNA组件（sgRNA和环状petRNA），其中环状petRNA表现出更高的稳定性。此外，使用RNA聚合酶II启动子（p2PE3系统）替代RNA聚合酶III可以避免转录终止问题，尤其在编辑富含T的靶序列时表现出优势。
7. PegRNA设计：prime editing的关键角色
PegRNA设计直接影响编辑效率。关键因素包括：PBS和RTT的长度与GC含量、间隔寡核苷酸（spacer）的特性（如DeepSpCas9评分）、pegRNA的二级结构（避免间隔区与PBS杂交）等。通常，对于点突变，C-to-T转换效率最高，而T-to-G颠换效率最低。通过引入破坏PAM的同义突变或同义有义突变（spegRNA），可以混淆MMR系统并提高靶向编辑效率。有多种在线工具（如PrimeDesign、PE-designer、DeepPrime等）可用于设计高效、特异的pegRNA。
7.1. 提高大片段插入或删除效率的新策略
传统的单pegRNA编辑对大片段操作效率低下。成对pegRNA策略应运而生，它们使用具有互补RTT序列的两个pegRNA。Twin-PE是首个此类方法，可实现长达约100 bp的插入和小于1 kb的删除。其他方法如Bi-PE、PRIME-Del、GRAND、PEDAR等在此基础上进行了改进，例如添加同源臂（HA）或使用野生型Cas9核酸酶以提高效率或处理更大片段。TJ-PE（template-jumping prime editing）则使用一种特殊的单pegRNA（含两个PBS）和一个ngRNA来模拟非LTR逆转录转座子的插入机制。对于三核苷酸重复扩展疾病的校正，PE-CORE策略利用成对pegRNA机制，在替换重复序列为同义密码子时效果最佳。对于超大片段插入，可将PE与Bxb1丝氨酸整合酶系统结合（如PASTE策略），实现大片段DNA的定点整合。
8. 转染或AAV转导率对编辑效能有显著影响
细胞转染效率是影响最终编辑结果的重要因素。使用包含所有编辑组件的单一质粒（all-in-one）可比多质粒共转染提升数倍效率。对于体内应用，腺相关病毒（AAV）的有限包装容量（约4.7 kb）是一大挑战。常见的解决方案是将PE编码基因分成两部分，分别包装到两个AAV中，并在细胞内通过内含肽（intein）介导的蛋白质连接进行组装，但效率低于全长PE。使用分裂PE（sPE），即将nSpCas9和MMLV-RT作为独立组分递送，无需内含肽拼接，可能提高递送效率。开发更紧凑的PE（如基于CjCas9的Mini-PE）以实现单AAV包装，是另一个研究方向，但目前其编辑效率仍有待提升。
9. 体内研究证实了prime editing的有效性和准确性
多项研究已使用AAV等载体在动物模型（如小鼠）中成功实施了prime editing，用于靶向编辑Dnmt1、Pah等基因，或治疗镰状细胞贫血、莱伯先天性黑蒙症等遗传病模型。这些研究普遍报告了可观的编辑效率（例如，使用AdV递送可达58.2%），且通过深度测序未检测到脱靶效应。这表明prime editing在保持高精度的同时，具备体内治疗的潜力，为其未来走向临床奠定了基础。
