发现6,7-二甲氧基喹唑啉-肼类化合物作为乙酰胆碱酯酶和β-分泌酶的双重抑制剂

《Biochimie》：Discovery of 6,7-Dimethoxyquinazoline-Hydrazide Hybrids as Dual Inhibitors of Acetylcholinesterase and β-Secretase

新型6,7-二甲氧基喹诺啉-肼杂合化合物（1-4）的合成及其对乙酰胆碱酯酶（AChE）和β-分泌酶（BACE-1）的抑制活性研究表明，化合物3和4具有显著抑制活性，其中化合物3对AChE的IC50为299 nM（优于参考药rivastigmine），对BACE-1的IC50为1.989 μM（优于参考药quercetin）。分子动力学模拟证实化合物3与酶复合物的稳定性。

　　

乔治·安东尼奥利（Giorgio Antoniolli）| 穆罕默德·T·M·内姆尔（Mohamed T.M. Nemr）| 塞缪尔·佩德罗·丹塔斯·马克斯（Samuel Pedro Dantas Marques）| 卡莱德·奥马尔·塞巴基（Khaled Omar Sebakhy）| 欧泽比奥·吉马良斯·巴尔博萨（Euzebio Guimar?es Barbosa）| 玛丽亚·特蕾莎·萨莱斯·特雷维桑（Maria Teresa Salles Trevisan）| 费尔南多·科埃略（Fernando Coelho）| 艾哈迈德·埃尔谢维（Ahmed Elshewy）

巴西圣保罗州坎皮纳斯市坎皮纳斯大学化学研究所

摘要

我们设计、合成了一系列新型的6,7-二甲氧基喹唑啉-肼类化合物（编号1-4），并使用定性检测方法评估了它们对乙酰胆碱酯酶（AChE）的抑制活性。实验结果显示，化合物3和4在薄层色谱（TLC）分析中表现出明显的抑制效果。这些化合物通过高分辨率质谱（HRMS）、红外光谱（IR）、¹H核磁共振（¹H NMR）和¹³C核磁共振（¹³C NMR）技术进行了表征。进一步的体外实验表明，化合物3对AChE的抑制活性显著，其IC₅₀值为299 nM，优于参考标准药物利伐斯明（IC₅₀值为439 nM）；同时，该化合物对β-分泌酶1（BACE-1）的抑制活性也较强，IC₅₀值为1.989 μM，优于对照物槲皮素（IC₅₀值为4.55 μM）。分子动力学模拟进一步证实了化合物3与AChE和BACE-1复合物的稳定性，这两种复合物在25纳秒内即可达到平衡状态，并且之后保持较低的RMSD值。平衡后的分析表明，化合物3的结合模式依赖于活性位点内的氢键和疏水相互作用。这些发现突显了化合物3对两种目标的强亲和力和特异性，使其具有作为双重抑制剂的潜力。

引言

阿尔茨海默病（AD）是一种主要影响老年人的神经系统疾病，病情发展缓慢。早期表现为短期记忆逐渐丧失，最终可能导致个人身份的丧失[1]。理解阿尔茨海默病发病机制的最大挑战在于其确切原因仍存在不确定性[2]。目前认为，多种因素与该疾病相关，包括乙酰胆碱（ACh）水平降低、β-淀粉样蛋白（Aβ）斑块的形成、神经纤维缠结（NFTs）的沉淀、金属稳态紊乱以及活性氧的过度产生[3],[4]。

阿尔茨海默病的经典假说认为，β-淀粉样蛋白（AβP）在脑内的异常积累和沉积会导致有毒纤维的形成，最终引发神经元死亡[5]。另一种重要假说是乙酰胆碱假说，该假说认为胆碱能神经元（ACh）的减少是导致阿尔茨海默病的主要原因[6]。实际上，ACh是大脑中维持记忆的关键神经递质。乙酰胆碱酯酶（AChE）会将ACh分解为胆碱和醋酸，因此抑制AChE的抑制剂（AChEIs）能够使ACh在突触中积累，从而改善阿尔茨海默病患者的胆碱能传递，进而改善记忆功能[7]。

目前，如加兰他敏（galantamine）、多奈哌齐（donepezil）、利伐斯明（rivastigmine）和塔克林（tacrine）等AChEIs已被批准用于治疗阿尔茨海默病的症状[8]。首个获得FDA批准的AChEI是塔克林，其化学名为9-氨基-1,2,3,4-四氢氨基吖啶（THA）。然而，由于具有肝毒性，该药物于2013年从市场上撤出[9]。多奈哌齐是一种双重作用机制的抗阿尔茨海默病药物，除了对Aβ肽引起的记忆障碍有积极作用外，它还是一种高效且选择性的AChEI[10]。

含氮杂环化合物因其多样的生物活性而在多个研究领域受到广泛关注。其中，喹唑啉类化合物尤为引人注目，并在药物发现研究中得到了广泛应用[11]。这种结构骨架被认为是设计新型分子的关键药效团，具有广泛的生物活性，包括抗癌[12],[13],[14],[15]、抗菌[14],[16]、抗癫痫[16]、抗阿尔茨海默病[17],[18]、抗病毒[16],[19],[20]、抗结核[20],[21],[22]、抗疟疾[20]、抗抑郁[20]、抗炎[16],[19]、抗氧化[19],[23]和降血糖[19],[20],[24]等作用。

喹唑啉衍生物在药物化学中表现出很强的应用潜力，尤其是在治疗神经退行性疾病（尤其是阿尔茨海默病）方面。多项研究表明，喹唑啉类化合物能够抑制AChE和/或β-分泌酶（BACE-1），这两种酶分别是胆碱能功能障碍和β-淀粉样蛋白生成的关键靶点[25],[26],[27],[28],[29],[30]。值得注意的是，有研究报道了一些喹唑啉衍生物同时对AChE和BACE-1具有抑制作用，这表明这类杂环骨架在双重靶点药物设计中具有巨大潜力[31]。然而，尽管取得了这些进展，许多研究中的生物活性仍较为中等，且通常仅限于单一靶点作用，或者主要基于计算机模拟（in silico）预测，缺乏严格的实验验证。

在本文中，我们描述了新型喹唑啉-肼类化合物的合成、表征以及体外和计算机模拟评估结果。据我们所知，目前尚无关于这类化合物及其衍生物对AChE和BACE-1抑制活性的研究报道[32],[33],[34],[35],[36],[37],[38],[39],[40],[41],[42],[43],[44]。也就是说，以往的研究主要探讨了AChE和BACE-1的单靶点或非双重抑制剂。

材料

喹唑啉和肼类化合物购自Oakwood Chemical公司，纯度较高。乙酰胆碱酯酶（AChE）酶、反应缓冲液（10倍浓缩液，使用前稀释至1倍）、含有胆碱氧化酶、过氧化物酶和显色剂的显影液、乙酰胆碱底物（冻干品）以及阳性对照药物利伐斯明（冻干品，一种已知的AChE抑制剂）均来自BioVision乙酰胆碱酯酶活性检测试剂盒（#K197）。

合成与表征

新型喹唑啉-肼类化合物的合成路线如图1所示。这些化合物通过一步反应合成，具体步骤详见实验部分。制备化合物1-4时使用了N,N-二异丙基乙胺和乙醇，并在回流条件下进行反应。

目标化合物1-4的产率较低（31%至63%），但足以满足本研究的需求。尽管产率不高，并未影响后续研究的进行。

结论

在本研究中，我们合成了四种喹唑啉-肼类化合物，作为潜在的阿尔茨海默病治疗药物，并评估了它们对AChE和BACE-1酶的抑制活性。在四种化合物中，只有化合物3和4对这两种酶均表现出抑制作用。其中，化合物3的抑制活性最强，其对AChE和BACE-1的IC₅₀值分别为0.299 μM和1.989 μM，优于参考阳性对照药物利伐斯明。

作者贡献声明

玛丽亚·特蕾莎·萨莱斯·特雷维桑（Maria Teresa Salles Trevisan）：负责初稿撰写及整体指导。欧泽比奥·吉马良斯·巴尔博萨（Euzebio Guimar?es Barbosa）：负责初稿撰写、方法学设计、实验操作及数据分析。塞缪尔·佩德罗·丹塔斯·马克斯（Samuel Pedro Dantas Marques）：负责初稿撰写、方法学设计、实验操作及数据分析。穆罕默德·T·M·内姆尔（Mohamed T. M. Nemr）：负责初稿撰写、方法学设计、实验操作及数据分析。卡莱德·奥马尔·塞巴基（Khaled Omar Sebakhy）：负责方法学设计、初稿撰写及修订工作。艾哈迈德·埃尔谢维（Ahmed Elshewy）：负责初稿撰写及整体指导。

利益冲突声明

作者声明不存在任何可能影响本研究结果的利益冲突。

数据可用性

研究数据包含在文章及其补充材料中。如有进一步疑问，请联系通讯作者。化合物的表征采用了傅里叶变换红外光谱（FTIR）、核磁共振（¹H和¹³C NMR）和高分辨率质谱（HRMS）技术，相关光谱已记录保存。

数据提供

数据可应要求提供。

资金来源

无。

利益冲突声明

作者声明不存在可能影响本文研究的财务利益冲突或个人关系。

致谢

作者感谢巴西高等教育人员培训协调基金会（Funda??o Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de Nível Superior, CAPES）的支持。