《Bioconjugate Chemistry》：NanoBondy Reaction through NeissLock Anhydride Allows Covalent Immune Cell Decoration
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为解决细胞表面修饰技术中存在的可逆性、非特异性或依赖基因编辑等局限性，牛津大学团队开发了一种新型“NanoBondy”技术。该技术将奈瑟锁(NessLock)化学与纳米抗体结合，实现了对未修饰蛋白靶点（如CD45）的诱导性、特异性共价连接。研究证实NanoBondy能在多种缓冲条件、温度及pH下快速（2分钟内）完成反应，并在NK细胞、T细胞等免疫细胞表面实现精准共价标记。这项工作为免疫细胞治疗、生物材料和诊断领域提供了无需基因编辑的模块化共价修饰新工具。
在生命科学与生物技术领域，精准操控细胞表面分子一直是研究人员追求的目标。无论是增强细胞治疗的效力，还是开发新型诊断工具，都离不开对细胞表面蛋白的稳定修饰。然而，现有的技术手段往往面临“鱼与熊掌不可兼得”的困境：传统的非共价结合（如抗体-抗原识别）虽然特异性高，但结合力弱，在体内复杂环境下容易解离，导致标记不稳定；化学交联剂虽然能形成稳定连接，却又缺乏靶向性，容易“误伤”细胞表面的其他蛋白，干扰正常功能。此外，虽然像HaloTag、SpyTag/SpyCatcher这样的基因编码标签系统能够实现共价连接，但它们大多源于细菌蛋白，在人体内可能引发免疫反应，且对治疗细胞进行基因工程改造本身也面临耗时、昂贵以及潜在安全风险等问题。因此，开发一种无需基因编辑、具有高度靶向性且能形成稳定共价连接的细胞表面修饰技术，成为了该领域一个迫切的需求。
为了突破这些瓶颈，来自牛津大学的研究团队独辟蹊径，将目光投向了一种名为“奈瑟锁”(NeissLock)的独特化学反应。该反应源自脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)中的FrpA蛋白的自处理模块(self-processing module， SPM)。其核心奥秘在于：当存在钙离子(Ca2+)时，SPM会发生自切割，并在其C末端形成一个高反应活性的天冬氨酸酸酐。这个酸酐就像一枚“生化手榴弹”的拉环，平时安全，一旦遇到钙离子这个“指令”，就会迅速“引爆”，其高亲电性使得它能与邻近蛋白质上的亲核基团（如赖氨酸的ε-氨基）发生不可逆的共价连接。更重要的是，反应后，SPM模块自身会离去，最终在目标蛋白上仅留下一个天冬氨酸“疤痕”，极大降低了免疫原性风险。
研究团队思考，能否将这个高效的“分子胶水”工厂，安装到一个精准的“制导系统”——纳米抗体(nanobody)上呢？纳米抗体是源自骆驼科动物的单域抗体片段，以其体积小、稳定性高、易于生产等优点著称。于是，一个名为“NanoBondy”的创新构想诞生了：将奈瑟锁的SPM模块通过一段柔性连接肽和精心设计的二硫键“钳位”(disulfide clamp)，融合到纳米抗体的C末端。这样一来，纳米抗体负责像“导弹”一样精准识别并结合细胞表面的特定靶标蛋白（本研究中选择的是广泛表达于造血细胞表面的长效标记物CD45），将SPM模块带到靶标附近；随后，加入钙离子激活SPM，产生的酸酐就能在极近的距离内，与靶标蛋白表面的氨基酸发生共价交联，实现“指哪打哪”的稳定标记。
这项研究成果正式发表在《Bioconjugate Chemistry》期刊上。为了验证这一设想，研究人员主要运用了以下几项关键技术方法：首先，利用AlphaFold2-multimer等计算工具预测纳米抗体与靶蛋白CD45的复合物结构，以指导二硫键钳位点的理性设计。其次，通过分子克隆与蛋白质工程，在大肠杆菌中表达并纯化了一系列针对CD45的纳米抗体及改造后的NanoBondy蛋白。接着，使用酶联免疫吸附试验(ELISA)和流式细胞术评估了纳米抗体及NanoBondy的结合特异性与亲和力。然后，通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结合考马斯亮蓝染色或蛋白质印迹法(Western blot)，在溶液体系及细胞表面直观检测并优化了钙离子诱导的共价交联反应。此外，还运用了交叉链接串联质谱(CL-MS/MS)技术，精确鉴定了NanoBondy与CD45蛋白之间的具体交联位点。本研究所用的细胞包括NK细胞系（YTS， NK92）、人胚肾细胞系(Expi293F)以及从人外周血白细胞中分离的原代CD8+T细胞。
研究结果
筛选出的纳米抗体候选分子展示了对CD45的特异性结合
研究人员从已报道的针对人CD45的纳米抗体库中筛选了5个靶向其d1d2结构域的候选分子。所有纳米抗体均能在大肠杆菌中可溶性表达并被纯化。ELISA和流式细胞术实验证实，这些纳米抗体均能以高亲和力特异性结合重组CD45蛋白以及表达内源性CD45的天然杀伤(NK)细胞系（YTS， NK92），而在不表达CD45的Expi293F细胞上则几乎无结合。其中，纳米抗体2H5展示了最高的结合亲和力，被选为后续构建NanoBondy的骨架。
设计的NanoBondy展示了对纯化CD45的特异性、诱导性偶联
基于AlphaFold的模型预测，研究人员将SPM模块通过一个包含二硫键钳位点（最初选在纳米抗体的R72C位点）的柔性连接肽融合到2H5纳米抗体的C端，构建了首个NanoBondy。为了便于在凝胶实验中分析，他们构建了融合有麦芽糖结合蛋白(MBP)的CD45d1d2重组蛋白(CD45d)。实验表明，在钙离子存在下，抗CD45的NanoBondy能够与CD45d发生特异性共价偶联，形成更高分子量的产物条带，而加入强亲核试剂羟胺(NH2OH)或使用无关靶标的抗IgG NanoBondy则能完全阻断或不会发生此反应。这证明了反应的诱导性和靶标特异性。
NanoBondy的钳位点和连接肽长度改变偶联效率
为了优化反应效率，研究人员测试了不同的二硫键钳位位点和连接肽长度。他们发现，选择不同的钳位点会显著影响共价偶联产物的产量，其中最初设计的R72C位点效率最高。同时，连接肽的长度也影响反应效率，过短（3或6个残基）的连接肽会降低产量，而长度在9个残基以上时，效率不再有显著提升。这表明通过理性设计可以调控酸酐与靶标蛋白上潜在反应位点的接近程度，从而优化偶联。
NanoBondy在多种条件下保持反应活性
研究人员系统评估了反应条件对NanoBondy效率的影响。结果表明，在HEPES缓冲盐溶液(HBS)中，反应比在Tris缓冲盐溶液(TBS)中更高效；在37°C下反应速度比25°C更快，仅需2分钟即可检测到产物，5分钟内基本完成；在pH 6.5至8.5的范围内反应均可进行，但在pH 8.5时速度较慢。这些数据证明了NanoBondy反应具有良好的鲁棒性，适用于多种生理相关条件。
交联MS/MS鉴定了NanoBondy-CD45d的交联位点
利用交叉链接串联质谱技术，研究人员精确绘制了NanoBondy酸酐与CD45d之间的共价连接图谱。结果显示，酸酐主要与CD45d上的4个不同赖氨酸(K)残基形成酰胺键，这些位点都位于AlphaFold预测的蛋白质相互作用界面附近，验证了模型的准确性。有趣的是，质谱还首次发现了酸酐与NanoBondy自身的一个丝氨酸(S56)形成了酯键，这揭示了反应潜在的“自伤”可能性，也为理解酸酐的反应性提供了新见解。
NanoBondy在细胞表面实现靶向共价偶联
最终，研究在真实的细胞环境中验证了NanoBondy的功效。在钙离子存在下，将抗CD45 NanoBondy与CD45阳性的YTS NK细胞或原代人CD8+T细胞共孵育后，通过蛋白质印迹分析，可以清晰观察到高分子量的特异性条带，对应于NanoBondy与内源性CD45的共价复合物。该反应可被羟胺抑制，且在使用无关NanoBondy或CD45阴性的细胞时不会发生，充分证明了其在复杂细胞表面的靶向特异性和共价连接能力。
+ T细胞表面也实现了钙离子依赖的共价连接。">
研究结论与意义
本研究成功开发并验证了“NanoBondy”这一新型技术平台。其核心结论是：通过将奈瑟锁(NeissLock)化学与纳米抗体相结合，并利用二硫键钳位和柔性连接肽进行工程化改造，可以将常规的非共价结合纳米抗体升级为具有诱导性、靶向性共价反应能力的“超级粘合剂”。该技术仅使用20种天然氨基酸，无需对靶细胞进行基因编辑，即可实现对抗原（如CD45）的特异性、快速、稳定共价标记。
这项工作的意义重大。首先，它突破了传统细胞表面修饰技术在稳定性、特异性或安全性方面的限制，提供了一种全新的、模块化的解决方案。其次，它首次将NeissLock化学的应用从已知结构的天然蛋白质对，拓展至缺乏实验结构信息的人工设计复合物，展示了计算结构预测与蛋白质工程相结合的巨大潜力。再者，研究证实了通过理性设计钳位点和连接肽可以调控共价反应效率，这为优化和推广该技术提供了通用策略。最后，研究团队进一步构建了“DuoBondy”，成功实现了在共价锚定于CD45的同时，携带另一个靶向PD-1的纳米抗体，这证明了NanoBondy技术具备搭载功能模块（如细胞因子、检查点抑制剂、酶等）的能力，为细胞治疗“装甲化”提供了极具前景的工具。
总之，NanoBondy技术为免疫治疗、生物材料、生物制造及诊断等领域开辟了新的可能性。它使得对免疫细胞等靶细胞进行精准、长效且安全的“工程化装饰”成为可能，有望推动下一代靶向治疗和细胞疗法的发展。尽管该技术目前偶联产率尚未达到百分之百，且存在潜在的“自伤”反应，但其创新性、通用性和良好的应用前景，使其成为蛋白质工程和合成生物学领域一项值得关注的重要进展。
