核磁共振谱学整合策略：精准解析抗体偶联药物中连接子-载荷的偶联状态

《Bioconjugate Chemistry》：An Integrated NMR Approach for Evaluating Linker-Payload Conjugation with Monoclonal Antibodies

本文聚焦于抗体偶联药物（ADC）表征中存在的技术挑战，为解决传统质谱方法无法在非破坏性条件下提供位点特异性信息的问题，研究人员发展了一种整合1H–13C ALSOFAST-HMQC与T2滤波1H CPMG实验的核磁共振（NMR）新策略。该策略能同时评估抗体高序结构（HOS）并监测连接子-载荷片段的状态，为ADC的生物偶联效率和结构完整性分析提供了一种强大的“一站式”解决方案，具有重要的方法学创新价值。

　　

抗体偶联药物（Antibody-Drug Conjugate, ADC）作为前沿的生物治疗药物，被誉为抗癌治疗的“智能导弹”。它将能精准识别癌细胞表面抗原的单克隆抗体（monoclonal antibody, mAb）与强效的细胞毒性药物（即“载荷”，payload）通过一个精心设计的“连接子”（linker）串联起来。这种设计旨在借助抗体的靶向性，将药物精准投送至肿瘤细胞内部，从而在提高疗效的同时最大限度地降低对正常组织的毒副作用。随着美国食品药品监督管理局（FDA）已批准十余款ADC上市，这一领域的研究热度持续攀升。

然而，ADC的“组装”过程并非易事。抗体上的偶联位点、连接子的稳定性以及最终的药物-抗体比率（Drug-to-Antibody Ratio, DAR）都会直接影响药物的安全性和有效性。当前，主流的ADC表征方法严重依赖质谱技术，它虽然能高效测定DAR，但通常需要对样品进行破坏性处理（如酶解），且难以在非生理环境下评估抗体自身的高序结构（Higher-Order Structure, HOS）变化以及连接子-载荷在完整ADC中的真实状态。换句话说，我们能够知道“导弹”上搭载了多少“弹头”，却难以在不拆解它的前提下，精细地检查“弹头”的挂载是否稳固，以及“导弹载体”本身的结构是否因挂载而发生形变。这成为了ADC研发与质量控制中一个亟待解决的关键瓶颈。

为了突破这一瓶颈，由Veronica Ghini、Sofia Siciliano、Leonardo Querci等人组成的研究团队在《Bioconjugate Chemistry》上发表了一项创新研究。他们开发并验证了一种基于核磁共振（Nuclear Magnetic Resonance, NMR）的整合分析流程，旨在对ADC进行全面的、非破坏性的“体检”。该方法的核心是同时观察ADC的两个组成部分：一是抗体本身的“健康状况”（HOS），二是连接子-载荷系统的“行为表现”。

研究人员选取了临床上广泛使用的靶向HER2的抗体药物——曲妥珠单抗（Trastuzumab）作为模型抗体，并将抗病毒药物瑞德西韦（Remdesivir）的衍生物片段作为连接子-载荷模型系统，构建了名为B242的ADC（DAR约为2.3）。他们巧妙地组合了两种NMR实验技术：甲基编辑的¹H–¹³C ALSOFAST-HMQC实验和T₂滤波的一维¹H CPMG实验。前者能够灵敏地监测分子量巨大的抗体蛋白质的HOS变化，尤其擅长捕捉甲基信号；后者则能有效滤除蛋白质本身的宽谱峰，选择性观测到连接子-载荷这类小分子片段的高分辨率信号，从而在完整的ADC样品中实现对两部分的同时、无损分析。

为了开展这项研究，作者主要采用了以下关键技术方法：利用N-羟基琥珀酰亚胺活化连接子-载荷系统，并将其与曲妥珠单抗的赖氨酸残基进行生物偶联，通过基质辅助激光解吸/电离质谱（MALDI-MS）测定所得ADC的DAR。在核磁共振分析部分，分别制备了曲妥珠单抗和ADC B242的样品，使用950 MHz核磁共振谱仪进行甲基编辑的¹H–¹³C ALSOFAST-HMQC实验以获取蛋白质指纹图谱；同时，使用600 MHz谱仪进行T₂滤波的¹H CPMG实验，以选择性地观测连接子-载荷的信号。对于游离的连接子-载荷系统，则使用700 MHz谱仪通过¹H–¹H TOCSY实验完成信号归属。所有数据使用Topspin软件处理，并利用分箱（binning）分析和化学位移差异计算（CCSD）进行谱图比较。

研究结果如下：

蛋白质检测谱图

• •
  曲妥珠单抗的NMR指纹图谱：研究人员首先获取了曲妥珠单抗的甲基编辑¹H–¹³C ALSOFAST-HMQC谱图作为参考。基于其氨基酸序列，理论上可观察到342个甲基信号，实际谱图中分辨出159个清晰信号。他们部分利用了已有的Fab（抗原结合片段）序列特异性归属数据（BMRB Entry 52228），并结合生物磁共振数据库（BMRB）的化学位移统计，对信号进行了识别和归类。
• •
  ADC B242的NMR指纹图谱与结合位点表征：对比ADC B242与游离曲妥珠单抗的谱图发现，两者的整体指纹高度相关（相关系数r=0.98），说明偶联反应没有引起抗体结构的剧烈改变。然而，通过更精细的化学位移差异分析，他们发现了一些局部效应：有14个明确的甲基信号在ADC谱图中几乎消失或强度显著降低，但没有观察到大的化学位移扰动。通过归属，这些受影响的信号对应于分布在抗体Fab片段轻重链上的特定异亮氨酸和亮氨酸残基。由于每个曲妥珠单抗单元含有44个赖氨酸（潜在反应位点），而实测DAR仅为2.3，这表明偶联反应并非位点特异性，而是发生在多个位点上的平均结果。

连接子-载荷检测实验

研究人员利用T₂滤波的¹H CPMG实验，成功地从ADC复杂的背景中分离出了连接子-载荷系统的信号。通过对比游离状态与偶联状态的谱图，他们观察到了连接子-载荷在结合后的不同行为模式：

（i）分子中己酸末端及烷基部分的信号（图中绿色标记）虽然存在显著的谱线增宽，但化学位移变化可忽略，表明这部分与抗体存在相互作用但构象相对固定。（ii）与羧酸相连的芳香环区域的所有信号（图中黑色标记）完全不可见，意味着这部分与抗体发生了强相互作用，导致信号增宽超出检测极限。（iii）核苷基团的信号（图中金色标记）未显示明显的谱线增宽，但出现了显著的化学位移变化，提示当连接子-载荷系统与抗体结合时，分子的这一部分发生了构象变化。

结论与讨论

该研究提出的整合NMR策略，为ADC表征提供了一种强大的互补性工具。传统的质谱方法虽能精确测定DAR，但难以提供位点特异性信息，且通常需要破坏样品。而NMR不仅能非破坏性地评估抗体载体关键的HOS——这是质谱无法比拟的优势，还能通过CPMG实验直接监测连接在抗体上的连接子-载荷的物理化学状态。

本研究证实，即使对于DAR低至1.3的另一种ADC（B238，使用阿霉素payload），该方法依然有效。这种方法的核心优势在于其“一站式”和普适性：它不依赖于样品的完全纯化（能容忍一定杂质），不要求对所有NMR信号进行完整的序列特异性归属即可进行整体指纹对比，并且原则上可适用于任何基于载体蛋白（不限于单抗）与通过柔性连接子连接的小分子载荷的生物制剂。HOS实验可作为抗体整体稳定性乃至偶联位点的报告器，而连接子-载荷检测实验则能用于评估不同溶液条件下连接子和载荷的稳定性，这对于确保ADC在体内的靶向递送与有效释放至关重要。

综上所述，这项研究成功展示了一种结合¹H–¹³C ALSOFAST-HMQC和T₂滤波¹H CPMG实验的NMR整合方法。该方法能够同时对ADC的抗体部分进行高序结构分析，并对连接子-载荷部分进行直接观测，从而在无需样品破坏、无需酶解的前提下，获得关于生物偶联效率、位点影响以及产物完整性的多层次信息。这为ADC的研发、工艺优化和质量控制提供了前所未有的深入洞察工具，标志着ADC分析表征领域的一项重要进展。