《Brain Research Bulletin》：Assessment of Angiopep-2 targeting intracerebral α-synuclein aggregates in a PFF-induced rat model of Parkinson’s disease based on 7
T CEST-MRI
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本研究致力于解决帕金森病（PD）早期诊断困难的问题。研究人员针对α-突触核蛋白（α-synuclein）异常聚集这一关键病理，评估了肽类探针Angiopep-2（ANG）在脑内靶向该聚集体的能力。通过分子对接、荧光结合实验证实了ANG对α-synuclein的高亲和力，并利用7T磁共振化学交换饱和转移（CEST）成像在PFF诱导的大鼠模型中成功实现了α-synuclein沉积的原位可视化。该研究为PD的早期、无辐射、高灵敏度分子影像诊断提供了一种新型、生物相容性好的CEST探针。
帕金森病（PD），作为阿尔茨海默病之后第二常见的神经系统退行性疾病，正困扰着全球数百万患者。其典型的运动症状——动作迟缓、肌肉僵硬和静止性震颤——通常在疾病中晚期才变得明显。而此时，大脑中负责调控运动的黑质多巴胺能神经元已有超过半数“凋零”，治疗窗口已然大大错过。因此，科学家们将目光投向了疾病的更早阶段。研究发现，一个名为α-突触核蛋白（α-synuclein）的蛋白，在大脑中的异常折叠和聚集，是驱动帕金森病发生发展的“元凶”之一，甚至在临床症状出现之前就已悄然沉积。如果能“看见”这些早期沉积的蛋白聚集体，无疑将为我们提前“狙击”帕金森病提供关键线索。
然而，如何“看见”大脑深处的这些微小病变，是一个巨大挑战。正电子发射断层扫描（PET）是常用的分子影像手段，但许多针对α-synuclein的PET示踪剂面临着特异性不高、脑摄取不足等问题。有没有一种无辐射、高分辨率的方法呢？磁共振成像（MRI）中的化学交换饱和转移（CEST）技术提供了新思路。它像一种“分子天线”，可以通过检测特定化学基团与周围水分子的质子交换，来间接“标记”并放大目标分子的信号。但要让这根“天线”在大脑里准确工作，首先需要一个能穿越“铜墙铁壁”——血脑屏障（BBB），并精准“抓住”α-synuclein聚集体的“导航员”。
一篇发表在《Brain Research Bulletin》上的研究，为我们介绍了一位潜力巨大的“双料特工”：Angiopep-2（ANG）。这是一个由19个氨基酸组成的短肽。它拥有两把“钥匙”：第一把是通过结合低密度脂蛋白受体相关蛋白-1（LRP1）高效穿越血脑屏障；第二把是其特殊的芳香族氨基酸序列，使其能与α-synuclein聚集体表面的疏水凹槽紧密结合。研究人员大胆假设，ANG可以作为CEST成像的“造影剂”，在进入大脑后特异性地锚定在α-synuclein沉积区域，从而被7T高场强MRI“看见”。
为了验证这一设想，研究人员系统性地开展了一系列工作。他们首先在计算机上进行“虚拟演练”（分子对接），预测了ANG与α-synuclein的结合模式和亲和力，结果显示两者结合紧密。接着，在试管中（体外）通过荧光结合实验证实，带有荧光标记的ANG确实能与α-synuclein和Aβ（阿尔茨海默病的特征蛋白）聚集体结合，且对α-synuclein的亲和力稍高。他们还测试了ANG自身的CEST效应，确定了其在3.2 ppm处有最佳信号，并优化了成像参数。
研究的核心是在动物体内（体内）验证。他们使用了预成型纤维（PFF）诱导的帕金森病大鼠模型，该模型能模拟α-synuclein在大脑内类似“朊病毒”的播散过程。四个月后，向模型鼠和对照鼠分别注射ANG或生理盐水（PBS），并进行动态CEST-MRI扫描。
关键实验方法包括：1. 分子对接模拟：使用多种平台（PEP-FOLD3, I-TASSER, AVOGADRO）生成ANG构象，用AutoDock软件预测其与α-synuclein和Aβ蛋白的结合。2. 体外荧光结合测定：通过荧光光谱法检测FITC标记的ANG与α-synuclein/Aβ聚集体的结合亲和力，计算解离常数（Kd）。3. CEST-MRI成像：在7.0T动物MRI扫描仪上，对ANG溶液模型和大鼠模型进行化学交换饱和转移成像，通过水饱和转移参照法校正B0场。4. 动物模型构建：使用立体定位注射技术，将α-synuclein PFFs注入SD大鼠右侧纹状体构建PD模型；同时构建胶质瘤和脑转移瘤模型作为对照。5. 组织学分析：对脑组织进行α-synuclein免疫组化染色和ANG/α-synuclein免疫荧光共定位分析。6. 行为学评估：通过步进测试、圆筒测试和莫里斯水迷宫评估模型鼠的运动和认知功能。
研究结果如下：
ANG shows high affinities to α-synuclein（ANG对α-突触核蛋白具有高亲和力）
分子对接显示，ANG与α-synuclein的最佳结合能为-6.2 kcal/mol，强于与Aβ蛋白的-4.9 kcal/mol。结合模式分析表明，ANG几乎全部氨基酸残基都参与了与α-synuclein的相互作用，提示其结合非常牢固。
In vitro fluorescence binding assay confirms ANG binding to aggregated α-synuclein（体外荧光结合实验证实ANG与聚集的α-突触核蛋白结合）
荧光结合实验表明，FITC-ANG的荧光强度与α-synuclein或Aβ聚集体浓度呈正相关。计算得出的解离常数（Kd）显示，ANG对α-synuclein的亲和力（Kd= 12.9 μmol/L）略高于对Aβ（Kd= 16.4 μmol/L），与分子对接结果一致。
The CEST effect changes with the saturation power（CEST效应随饱和功率变化）
体外模型实验证实，ANG在3.2 ppm处产生显著的CEST效应，且效应强度随其浓度、饱和功率和饱和时间的增加而增强。最终确定4秒饱和时间和3.0 μT饱和功率为体内成像的优化参数。
7 T MRI-CEST imaging detects α-synuclein aggregates in vivo（7T MRI-CEST成像在体检测α-突触核蛋白聚集体）
这是研究的核心发现。在体成像显示，注射ANG后，PFF模型鼠大脑右侧纹状体和双侧前额叶皮层的CEST信号比率（CESTR）显著增强，在60分钟达到峰值（15.3 ± 0.2），显著高于注射PBS的模型鼠和注射ANG的对照鼠。而对照鼠仅出现轻微的信号升高。更重要的是，CEST信号增强的区域与免疫组化显示的α-synuclein沉积区域高度重合，且两者面积呈强正相关（R2 = 0.967）。免疫荧光进一步证实了ANG与α-synuclein在病灶部位的共定位。
α-synuclein PFF injection induces motor deficits but spares cognitive function（α-突触核蛋白PFF注射诱导运动缺陷但保留认知功能）
行为学测试证实，PFF模型鼠表现出明显的运动功能障碍，如对侧前肢运用减少，这与帕金森病的运动症状一致。然而，在评估空间学习和记忆的莫里斯水迷宫测试中，模型鼠与对照鼠无显著差异，表明该模型在成像时间点主要表现为早期、特异性的运动病理，而非广泛的认知衰退。
ANG exhibits excellent biocompatibility（ANG表现出优异的生物相容性）
安全性实验表明，静脉注射ANG的小鼠体重增长正常，肝功能和血常规指标与对照组无显著差异，心、肝、脾、肺、肾等重要器官的病理切片也未发现明显异常，证明ANG具有良好的生物安全性。
研究结论与重要意义：
本研究成功证明，肽类探针Angiopep-2（ANG）能够作为一种新型的CEST-MRI对比剂，在PFF诱导的帕金森病大鼠模型中，实现脑内α-突触核蛋白（α-synuclein）异常聚集体的特异性靶向与无创可视化。其意义在于：
- 1.
提供早期诊断新工具：α-synuclein沉积是帕金森病的上游病理事件，早于神经元大量丢失。ANG-CEST成像有望在临床症状出现前检测到病理蛋白的沉积，为疾病的超早期诊断和干预提供了可能。
- 2.
实现无辐射分子成像：与需要放射性示踪剂的PET技术不同，CEST-MRI完全无辐射，可进行重复、动态扫描，更适用于长期随访和疗效监测。
- 3.
验证双功能探针策略：ANG的成功应用，验证了整合“血脑屏障穿透”（通过LRP1受体）与“病理靶向”（通过疏水/π-π堆叠作用）的双功能分子设计思路的有效性。其在阿尔茨海默病（靶向Aβ）和帕金森病（靶向α-synuclein）中的初步应用，显示了其在神经退行性疾病分子影像领域的广泛潜力。
- 4.
阐明信号特异性：研究通过关键的对照实验（在血管通透性极高的胶质瘤和脑转移瘤模型中，ANG未显示信号滞留），有力排除了非特异性血管渗漏（EPR效应）是PFF模型中信号增强的主要原因，强有力地证明了ANG-CEST信号来源于与α-synuclein聚集体的特异性结合。
当然，研究也指出了局限性，如ANG对α-synuclein和Aβ均有一定亲和力，其特异性有待进一步提高；PFF动物模型不能完全模拟人类帕金森病的复杂病因。未来的研究需要在特异性更高的探针设计、大型动物模型验证以及与临床前驱期症状、血液生物标志物等多模态信息结合方面继续探索。尽管如此，这项研究无疑为帕金森病的早期精准影像诊断开辟了一条充满希望的新路径。
