整合性单细胞与空间转录组学研究揭示：S100A16+ 肿瘤内皮细胞在肝细胞癌中驱动血管生成并抑制免疫反应

《Cancer Letters》：Integrative Single-Cell and Spatial Transcriptomic Reveals S100A16+ Tumor Endothelial Cells Drive Angiogenesis and Immunosuppression in Hepatocellular Carcinoma

肝癌中S100A16+肿瘤相关内皮细胞促进血管生成和免疫抑制，与患者预后不良及免疫治疗抵抗相关，为肝癌治疗提供新靶点。

　　

王向旭|金硕|赵晓婷|刘云鹏|程毅涵|季红晨|艾丽萍|高媛|孙国贵|张健|张红梅

中国西安第四军医大学西京医院临床肿瘤科

摘要

肝细胞癌（HCC）仍然是全球最致命的恶性肿瘤之一。肿瘤相关内皮细胞（TECs）在HCC的进展中起着关键作用，然而它们的分子特征和功能贡献仍知之甚少。我们对49个样本进行了全面的单细胞RNA测序和空间转录组分析，共获得了145,692个高质量的单细胞数据。来自12个样本的空间转录组数据包括正常肝组织、肿瘤边界区域和HCC组织，共检测到49,091个空间点。通过使用人脐静脉内皮细胞（HUVECs）进行体外实验，并利用内皮细胞特异性敲除小鼠进行体内验证，我们鉴定并表征了内皮细胞亚群的功能。临床验证使用了90对HCC样本的组织微阵列和接受免疫治疗的晚期HCC患者队列。我们发现了6种不同的内皮细胞亚群，其中S100A16⁺ TECs在HCC组织中显著富集。S100A16⁺ TECs的特征与较短的总生存期和无病生存期相关。功能分析表明，S100A16的过表达促进了内皮细胞的增殖、迁移和管状形成能力。RNA测序确定CCL20和TGF-β2是关键的下游效应因子。共培养实验和多重免疫荧光分析显示，S100A16+ TECs促进了调节性T细胞（Treg）的分化。内皮细胞特异性S100A16敲除显著减少了小鼠的肿瘤血管生成、Tregs浸润和HCC生长。临床验证显示，高水平的S100A16⁺ TECs与血管侵袭、免疫治疗抵抗和较短的进展无生存期相关。我们的研究将S100A16⁺ TECs确定为一种独特的内皮亚群，它通过协同促进病理血管生成和免疫抑制来驱动HCC的进展，这为HCC的免疫治疗反应预测提供了一个潜在的治疗靶点和生物标志物。

引言

肝细胞癌（HCC）是最常见的原发性肝脏恶性肿瘤，是全球癌症相关死亡的第三大原因[1]。尽管诊断方法和治疗策略有所改进，但HCC的发病率和死亡率仍在上升，总体5年生存率仍然很低[2, 3, 4]。目前的系统疗法，包括酪氨酸激酶抑制剂（如索拉非尼和仑伐替尼）和免疫检查点抑制剂，在部分患者中显示出临床益处[5, 6, 7]。然而，由于肿瘤微环境（TME）的显著异质性和免疫抑制性质，大多数患者无法获得持久的反应[8, 9]。因此，寻找新的分子靶点并开发有效的治疗策略对于改善HCC的治疗效果至关重要。

在肿瘤发生和进展过程中，TME会发生动态重塑，形成一个有利于恶性生长和药物抵抗的微环境[10, 11, 12]。在基质成分中，内皮细胞（ECs）是调节肿瘤血管生成的关键因素，并对HCC的生物学特性产生深远影响[9, 10, 11]。异常的血管不仅导致缺氧和药物输送受阻，还为肿瘤的侵袭和扩散提供了通道。肿瘤相关内皮细胞（TECs）通过分泌血管内皮生长因子（VEGF）和转化生长因子-β（TGF-β）等血管生成和免疫调节因子进一步促进HCC的进展[14, 15]。通过塑造肿瘤血管的结构并调节免疫细胞的分布和活性，TECs积极促进了肿瘤的侵袭性和治疗抵抗[16]。因此，解析TECs的功能异质性对于理解TME内的复杂相互作用以及发现新的治疗机会至关重要[13, 17]。

单细胞RNA测序（scRNA-seq）和空间转录组学的最新进展使我们能够以前所未有的视角了解实体肿瘤（包括HCC）中的细胞异质性和细胞间相互作用。利用这些技术，我们发现了一个先前未被识别的内皮细胞亚群，其特征是高表达S100A16（S100A16⁺ TECs）。这种内皮亚群在HCC组织中显著富集，位于血管生成微环境中，并与侵袭性肿瘤特征相关。功能实验表明，S100A16增强了内皮细胞的增殖、迁移和管状形成，从而促进了肿瘤的血管生成。此外，共培养实验表明，S100A16⁺ TECs促进了HCC细胞的生长和侵袭，突显了它们在血管重塑和肿瘤进展中的双重作用。

在这项研究中，我们对HCC中的S100A16⁺ TECs进行了全面的多组学分析。我们发现它们的富集与不良临床结果相关，这表明S100A16⁺ TECs可能既是一个预后生物标志物，也是一个潜在的治疗靶点。我们的发现扩展了目前对HCC中内皮异质性的理解，并为针对肿瘤微环境的抗血管生成策略的开发提供了新的视角。

HCC单细胞RNA测序数据的收集与处理

我们从GEO数据库（GSE235057[18]和GSE156625[19]）中获得了两个公开的单细胞RNA测序数据集，其中包含匹配的正常组织和HCC肿瘤组织，共49个样本（24个肿瘤样本和25个正常样本）。质量控制标准如下：nCount_RNA <10,000, nFeature_RNA <5,000, nFeature_RNA >100, percent.mt_RNA <10%。随后，使用SoupX[20]和decontX[21]算法去除了RNA含量过高的细胞。

HCC微环境的单细胞转录组图谱分析

肿瘤免疫微环境在HCC的发展和进展中起着关键作用。为了全面研究HCC的微环境特征，我们收集了49个样本，包括25个正常肝组织和24个HCC组织。经过污染去除和质量控制后，我们获得了145,692个高质量的单细胞（正常组49,459个细胞，肿瘤组96,233个细胞）。此外，我们还收集了4名患者的空间转录组数据，包括12个

讨论

在这项研究中，我们发现了一种新的肿瘤相关内皮细胞亚群，其特征是高表达S100A16（S100A16⁺ TECs），这种细胞在HCC肿瘤微环境中富集，并在促进病理血管生成和免疫抑制方面发挥双重作用。通过整合单细胞和空间转录组分析，我们发现S100A16⁺ TECs在肿瘤组织中特异性富集，并与多种促血管生成因子共定位。功能实验表明

结论

总之，这项研究通过整合单细胞和空间转录组分析、功能实验以及临床验证，揭示了S100A16⁺ TECs是一种独特的内皮亚群，它促进了血管生成，驱动了Treg介导的免疫抑制，并预示着不良的预后和免疫治疗抵抗。从机制上讲，S100A16⁺ TECs分泌CCL20和TGF-β2，建立了免疫抑制微环境，同时增强了病理

CRediT作者贡献声明

刘云鹏：研究、正式分析、数据管理。赵晓婷：撰写初稿、验证、方法学设计、正式分析、概念构建。金硕：监督、正式分析、数据管理。王向旭：撰写与编辑、撰写初稿、监督、软件应用、研究、正式分析、数据管理、概念构建。张红梅：撰写与编辑、研究、资金获取、概念构建。张健：撰写——

数据共享声明

本研究中的所有数据均可从TCGA数据库（https://portal. gdc.cancer.gov/）和GEO数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/（GSE235057, GSE156625）获取。空间转录组数据来自基因组序列档案（HRA000437）。所有其他数据可在正文或补充材料中找到。

伦理批准和参与同意

这项利用存档HCC样本的回顾性研究获得了西京医院伦理委员会的批准（批准编号：KY20232147-C-1）。由于该研究为回顾性设计且未对标准患者护理方案进行任何干预，委员会免除了知情同意的要求。所有程序均严格遵循《赫尔辛基宣言》中规定的伦理原则。

利益声明

作者声明没有竞争利益。

资助

本研究得到了陕西省重点实验室项目（2025SYS-SYSZD-029）、陕西省科技创新人才计划 - 科技创新团队项目（2023-CX-TD-67）、国家卫生健康委员会医学与健康科学技术发展专项（WKZX2024CX102209）、西京创新研究院联合创新基金（LHJJ24YX01）、医疗人员技术技能提升项目（2024XJSY01）的支持

利益冲突声明

作者声明没有可能影响本文工作的已知竞争利益或个人关系。

? 作者声明以下财务利益/个人关系可能被视为潜在的竞争利益：

张红梅报告称获得了第四军医大学的财务支持。如果有其他作者，他们也声明没有已知的竞争利益或

致谢

在准备这项工作时，作者使用了Claude 3.7 Sonnet工具来提高文章的可读性和语言清晰度。使用该工具后，作者根据需要审阅和编辑了内容，并对发表文章的内容负全责。