三(2,4-二-叔丁基苯基)磷酸盐通过破坏能量稳态导致幼年小鼠的心脏损伤：重点关注线粒体功能障碍

《Chemico-Biological Interactions》：Tris(2,4-di-tert-butylphenyl) phosphate induces cardiac injury in juvenile mice by disrupting energy homeostasis: Focus on mitochondrial impairment

本研究通过给3周龄雄性小鼠灌服不同剂量的AO168=O，发现其导致心脏结构紊乱、心肌损伤及收缩功能障碍，机制涉及氧化应激和线粒体功能障碍，代谢组学显示心脏甘油脂代谢紊乱。

　　

陈向翔|夏亚楠|冯丽华|李浩能|李阳娥|黄世翔|徐恒毅|刘阳

中国南昌大学江西医学院第二附属医院儿科，南昌330006

摘要

三(2,4-二-叔丁基苯基)磷酸酯（AO168 = O）是一种新型有机磷酸酯，在多个行业中广泛应用，也频繁出现在环境中，对生态和公共健康构成严重威胁。青少年正处于心脏功能成熟的关键阶段，其生理特征可能使他们更容易受到AO168 = O的影响。然而，关于AO168 = O对青少年的毒理学效应及其机制的研究仍不充分。在本研究中，我们建立了3周大的雄性小鼠模型，通过每日灌胃给予AO168 = O（剂量分别为0、0.7、7或70 μg/kg），持续28天，以评估其潜在的心脏效应。结果显示，AO168 = O暴露会导致小鼠心脏损伤，表现为心脏结构紊乱、心肌损伤和收缩功能障碍。此外，我们的研究还发现AO168 = O通过诱导氧化应激导致线粒体损伤，这可能是心脏损伤的原因之一。转录组分析表明，AO168 = O可上调或下调心肌组织中的多个基因，并引起广泛的代谢变化。AO168 = O暴露还会扰乱心脏糖脂代谢，降低能量水平，这些变化可能与心脏损伤有关。

总体而言，本研究表明AO168 = O可能对青少年心脏产生有害影响，强调了青少年心脏的脆弱性，并为系统评估健康风险提供了科学依据。

引言

有机磷酸酯抗氧化剂（OPAs）是一类合成有机抗氧化剂，广泛用于塑料制造中以提高聚合物的稳定性[1]。2019年，中国和美国的OPAs产量分别为96,000吨和87,000吨[2]。由于与塑料聚合物的结合力较弱，这些抗氧化剂容易渗入环境并被氧化，从而生成新的有机磷酸酯（OPEs）[3, 4]。三(2,4-二-叔丁基苯基)磷酸酯（AO168）是最常用的OPAs之一，在特定条件下可氧化为AO168 = O，转化率高达95.6%[5, 6]。由于其强环境持久性、显著的生物累积能力和在土壤、沉积物、食物及人类相关物品中的广泛存在，AO168 = O已成为环境科学领域中最令人担忧的新兴污染物之一[7]。最新研究表明，与传统OPEs（如三苯基磷酸酯（TPHP）和三(2-氯异丙基)磷酸酯（TCEP）相比，AO168 = O在环境中的浓度通常更高[8, 9]。人类接触这些化学物质的主要途径包括饮食摄入[10]。值得注意的是，周等人报告称，儿童从乳制品中摄入的AO168 = O量显著高于成人和老年人[11]。此外，中国儿童尿液样本中AO168 = O的检出率为55%，表明超过一半的儿童体内存在该化合物[12]。

环境污染物（EPs）是心血管疾病的风险因素；根据全球疾病负担研究，2019年约有900万人死于环境污染物相关疾病，其中超过60%死于心血管疾病[13, 14]。心脏作为负责循环和血流动力学调节的关键器官，其稳定运行对维持全身生理平衡至关重要。一项横断面研究表明，接触混合OPEs与心血管疾病发病率增加呈正相关，其中二苯基磷酸酯（DPHP）是主要致病因素[15]。此外，徐等人报告称，小鼠暴露于TPHP 30天后会出现心肌损伤标志物升高和心脏结构异常[16]。斑马鱼模型研究显示，AO168 = O暴露会引发心脏毒性效应，包括心包水肿、心脏循环缺陷、心率下降和心脏畸形[5]。值得注意的是，尽管青少年的心脏传导系统已基本形成，但其神经支配和离子通道功能尚未完全成熟[17]。

虽然心肌细胞不再大量增殖，但心肌纤维仍继续发育以增加心肌质量[18]。与健康成人相比，青少年的整体心脏收缩力和收缩储备能力相对较低[19]。这些特征降低了心脏对污染物的耐受阈值，从而增加了青少年对AO168 = O的敏感性。然而，关于青少年暴露于AO168 = O后的心脏效应的相关研究仍较为有限。

先前的研究表明，线粒体是一些OPEs（如TPHP和TCEP）的易感靶标，也是这些化合物引起的氧化损伤的主要来源[16, 20, 21]。值得注意的是，在化学毒性研究中，线粒体产生的氧化应激可能是毒性的机制之一[22]。此外，线粒体形态变化与稳态的关系也逐渐受到关注[23]。线粒体形态的变化包括融合和分裂，线粒体通过这两种过程不断调整其形态以适应能量需求的变化[24]。环境线粒体功能障碍理论逐渐被视为评估化学物质引起代谢紊乱的新范式[25]。研究表明，某些OPEs可诱导线粒体功能障碍，包括活性氧（ROS）的产生和线粒体膜电位的降低[26, 27]。此外，多种OPEs被认定为新兴的环境内分泌干扰物，可影响生物体并引发各种疾病（如代谢紊乱）[28, 29]。例如，在一系列体内和体外研究中，研究人员将实验模型暴露于OPEs，观察到胰岛素抵抗、脂质沉积异常和糖脂代谢紊乱；同时，他们还检测到与糖脂代谢紊乱相关的编码基因表达发生显著变化[30, 31, 32, 33, 34]。因此，本研究采用C57BL/6J小鼠作为模型，系统探讨AO168 = O对心脏的毒性效应。从线粒体动态稳态和心脏能量稳态的角度评估了AO168 = O的心脏毒性，有助于探索预防青少年心脏毒性的精准干预措施。

材料与剂量选择

苏州中新生物技术有限公司提供了AO168 = O（CAS 95906-11-9，纯度>98%）。实验中，将粉末与纯净水混合后，用超声波处理半小时。儿童摄入乳制品时，他们可能摄入的AO168 = O量高达63.2 ng/kg[11]。基于60 ng/kg的代表性浓度，通过综合分析多种因素确定了小鼠的暴露剂量。

青少年阶段暴露于AO168 = O会导致生长迟缓和心脏结构完整性受损

我们进行了为期28天的暴露实验，以研究青少年阶段暴露于AO168 = O是否会导致不良效应，实验流程如图1A所示。暴露组分为：L-O（低剂量AO168 = O，0.7 μg/kg）、M-O（中等剂量AO168 = O，7 μg/kg）和H-O（高剂量AO168 = O，70 μg/kg），对照组则给予超纯水。H-O组的小鼠体重增长率和最终BMI明显低于其他组。

讨论

鉴于AO168 = O在全球环境中广泛分布并在多种生产活动中大量使用，人们在日常生活中不可避免地会接触到该物质。值得注意的是，从小鼠数据得出的等效剂量与周等人之前报道的人类AO168 = O暴露水平基本一致[11, 42]。这一发现表明，现实世界中青少年群体的暴露浓度

结论

本研究首次阐明了AO168 = O暴露对青少年小鼠心脏的毒性效应，并揭示了线粒体损伤和能量稳态紊乱在此过程中的关键作用。暴露于AO168 = O后，青少年小鼠出现心脏功能和结构异常，包括心脏结构紊乱、心肌损伤和收缩功能障碍。心脏毒性源于严重的氧化应激，这与

作者贡献声明

徐恒毅：项目管理、概念构思。刘阳：写作——审稿与编辑、资源管理、项目管理、概念构思。陈向翔：写作——审稿与编辑、初稿撰写、概念构思。夏亚楠：写作——审稿与编辑、软件使用、数据管理。李阳娥：方法学设计、实验实施。黄世翔：方法学设计、实验实施。冯丽华：结果验证、方法学设计。李浩能：数据可视化、结果验证

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。

数据获取

数据可应要求提供。

资助

本研究得到了国家自然科学基金（项目编号：82060162）、江西省自然科学基金（重点项目：20224ACB206013）和江西省自然科学基金（项目编号：20242BAB25461）的支持。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

作者感谢南昌大学食品科学与资源国家重点实验室提供的必要实验设施。