Fe?O?纳米颗粒的剂量和粒径对公牛精子冷冻保存的影响

《Cryobiology》：Dose- and size-dependent effects of Fe 3O 4 nanoparticles on bull sperm cryopreservation

Fe3O4纳米颗粒不同尺寸和浓度对牛精子冷冻保存的影响研究表明，6nm颗粒在两种浓度下均未显著降低精子活率与运动能力，而20nm颗粒高浓度组（50μg/mL）导致线粒体膜电位下降，80nm颗粒未观察到显著毒性。表面电荷随尺寸变化，显微镜显示纳米颗粒富集于精子头部

　　

摘要

Fe₃O₄纳米颗粒（Fe₃O₄ NPs）在健康科学领域得到广泛应用，包括生殖生物技术。在生殖系统中，它们被用于精子冷冻保存、纳米纯化、药物递送和毒性评估。然而，大多数研究仅评估了单一尺寸和剂量的Fe₃O₄ NPs，尽管它们的生物效应可能随尺寸的不同而变化。因此，本研究旨在探讨不同尺寸和浓度的磁性Fe₃O₄ NPs对公牛精子冷冻保存的影响。首先合成了三种尺寸（约6纳米、约20纳米和约80纳米）的Fe₃O₄ NPs，并将两种浓度（10微克/毫升和50微克/毫升）添加到稀释的精液样本中，同时添加了商业扩展剂并进行冷冻保存。研究结果表明，在两种剂量下，6纳米的Fe₃O₄ NPs保持了与对照组相似的总运动能力和渐进运动能力；而只有Fe_20-10组观察到这两种运动能力参数的下降。在运动学参数、顶体完整性或质膜完整性方面未发现统计学上的显著差异。相反，20纳米和80纳米组在50微克/毫升剂量下表现出线粒体膜电位（MMP）的降低。与对照组相比，所有实验组的染色质凝聚程度都有所改善，这表明纳米颗粒处理减少了DNA损伤。Zeta电位测量显示表面电荷随颗粒尺寸变化，显微镜观察发现带正电的Fe₃O₄ NPs在精子头部区域积聚。总体而言，本研究显示Fe₃O₄ NPs表现出明显的尺寸依赖性特征，强调了确定用于精子学应用的最佳纳米颗粒尺寸的初步试验的重要性。

引言

冷冻保存是一种能够长期保持精子复杂结构及激活或 capacitation 过程中所需分子相互作用的保存方法。目前，冷冻保存技术已应用于高级实验室和农业环境，科学界长期以来一直在研究精子在冷冻过程中的细胞反应[1]。使用多种冷冻保护剂（如甘油、乙二醇、DMSO、海藻糖、聚乙二醇和聚乙烯吡咯烷酮）成功实现了精子的冷冻。冷冻保护剂可防止细胞内外形成冰晶，并控制细胞膜中的脂质相变，从而避免解冻过程中的再结晶损伤[2]。

了解精子在冷冻过程中的生理复杂性对于实现最佳冷冻效果至关重要。小尺寸和大表面积是精子冷冻生物学的关键特征[3]，它们影响精子细胞质内的粘度和玻璃化转变温度[4]。在没有冷冻保护剂的情况下，冷冲击和冰晶的形成会导致精子细胞器的破坏[5]，并对细胞成分（DNA、顶体和质膜）造成氧化应激，干扰细胞的重要功能[6]。活性氧（ROS），包括过氧化氢（H₂O₂）、超氧阴离子（O₂^?）和羟基自由基（OH•），可能引发细胞凋亡、膜脂质过氧化、线粒体功能障碍和DNA损伤[7]。为了解决这些问题并确保最佳的精子冷冻效果，科学家们使用了各种冷冻保护剂和抗氧化剂[8, 9]。然而，近年来纳米技术的进步使得纳米抗氧化剂和各种纳米颗粒（NPs）在精子冷冻保存研究中得到应用，作为抗氧化剂、抗菌剂和药物载体[10, 11, 12]。近期研究表明，纳米抗氧化剂可以改善总运动能力和渐进运动能力，减少ROS诱导的细胞死亡，并有助于维持膜和DNA的完整性[13, 14]。最近的研究还发现，碳烟涂层可以消除人类精子的双因素冷冻损伤，使冷冻保护剂的选择变得无关紧要[15]。除了冷冻保存外，纳米技术还应用于精子纯化[16]、纳米传感器开发[17]和多种毒性研究[18]。

磁性纳米颗粒（MNPs）在最近受到关注的纳米材料中尤为突出。特别是氧化铁纳米颗粒（Fe₃O₄ NPs）在多种生物医学应用中得到广泛应用，包括免疫隔离、磁弛豫开关、药物递送、磁热疗和磁共振成像（MRI）[19, 20, 21]。氧化铁纳米颗粒还被用于精子冷冻保存研究的不同领域，如作为不同维生素的载体[22]、精子性别鉴定[23, 24]、精子学效应评估[25]、抗菌活性研究[26]和毒性评估[27]。然而，文献回顾显示，这些研究通常使用单一尺寸的Fe₃O₄ NPs，未探讨不同纳米颗粒尺寸对精子的影响。例如，Basioura等人（2020年）报告称，直径为40纳米的Fe₃O₄ NPs在192微克/毫升和128微克/毫升的浓度下对猪精子的CASA参数没有影响[28]；Caldeira等人（2018年）也证明，DMSA包覆的Fe₃O₄ NPs（8.1纳米）在10、30和60微克/毫升的剂量下对公牛精子没有正面或负面影响[29]。

然而，Watanabe等人指出，颗粒尺寸与纳米颗粒的毒性密切相关。此外，纳米颗粒的流体动力学尺寸对纳米颗粒与细胞的相互作用和细胞反应至关重要[30]。不同尺寸的纳米颗粒在不同类型的细胞中产生了不同的结果。Xie等人（2016年）报告称，当氧化铁纳米颗粒尺寸增大时，人类肝癌细胞的线粒体功能障碍增加，而Zhang等人则报告称，当氧化铁纳米颗粒尺寸减小时，鸡巨噬细胞的细胞毒性增加[31, 32]。然而，文献中尚未找到关于不同尺寸纳米材料对公牛精子影响的研究。

因此，本研究旨在评估不同尺寸（约6纳米、约20纳米和约80纳米）和剂量（10微克/毫升和50微克/毫升）的Fe₃O₄ NPs对公牛精子冷冻保存效果的影响。鉴于它们调节冰核形成和与精子膜相互作用的能力，我们假设Fe₃O₄ NPs根据其尺寸和浓度可能影响精子的运动能力、存活率、线粒体功能和解冻后的膜完整性。

材料与方法

实验设计首先包括Fe₃O₄ NPs的合成和表征。收集、混合和稀释精液后，样本被分为对照组和Fe₃O₄ NPs处理组。添加纳米颗粒的样本根据标准协议平衡后进行冷冻，然后储存在液氮中。解冻后，检测运动能力、运动学参数、膜和顶体完整性以及线粒体膜电位、染色质结构等。

表征

图3显示了不同尺寸合成的Fe₃O₄ NPs的STEM图像。观察到Fe₃O₄ NPs呈球形，尺寸分别为约6纳米、约20纳米和约80纳米。在加入精子稀释液之前，Fe₃O₄ NPs经过约5分钟的超声处理以防止聚集。

图4显示了动态光散射（DLS）结果。所有三种尺寸的Fe₃O₄ NPs的流体动力学尺寸均显著大于其核心直径。

讨论

本研究探讨了三种不同尺寸（6纳米、20纳米和80纳米）和两种不同剂量（10微克/毫升和50微克/毫升）的Fe₃O₄ NPs对公牛精子在冷冻过程中的影响。首先，需要说明合成的Fe₃O₄ NPs的表征结果。STEM图像显示，颗粒核心直径约为6纳米、20纳米和80纳米，与研究预期一致。然而，DLS分析显示其流体动力学直径...

结论

研究表明，Fe₃O₄ NPs在精子冷冻研究中不会造成任何伤害。文献回顾中发现，Fe₃O₄ NPs通常只在单一尺寸和剂量下进行测试。然而，已知纳米颗粒的尺寸变化会影响其Zeta电位、磁性和效率。本研究在文献中具有重要意义，因为它是首次测试不同尺寸和剂量的Fe₃O₄ NPs的研究之一，为比较提供了机会。

作者贡献声明

Ali Erdem ?ztürk：撰写——初稿、可视化、验证、项目管理、方法论、概念化。?eyma Dad?：验证、资源、方法论。Mustafa Bodu：撰写——初稿、验证、方法论、研究。Oya Korkmaz：撰写——初稿、研究。Yunus Emre Atay：方法论、概念化。Serpil Sar??zkan：撰写——审阅与编辑、形式分析。Ramazan üzen：研究、形式分析。Halil Ayd?n

伦理声明

未与研究中使用的动物进行接触。未用于生产的剩余样本被纳入调查，这些样本是通过标准生产程序获得的。在相关研究中，Erciyes大学动物实验地方伦理委员会表示，根据2022年6月2日（编号22/138）和2022年7月7日（编号22/151）的决定，无需伦理委员会批准。

写作过程中生成式AI和AI辅助技术的声明

在准备这项工作时，作者使用Grammarly和ChatGPT来编辑语言。使用这些工具/服务后，作者根据需要审阅和修改了内容，并对发表文章的内容负全责。

资助

土耳其科学技术研究委员会（TüB?TAK，项目代码：123O073）支持了这项研究。

利益冲突声明

作者声明与本研究无关的任何利益冲突。不存在可能不恰当地影响或偏倚本文内容的财务或个人关系。

致谢

我们感谢土耳其科学技术研究委员会以代码123O073支持这项研究。同时感谢Erciyes大学研究主任办公室对本文的校对工作。