《The Crop Journal》：CRISPR/Cas9 multiplex editing of four
TaSK41 genes increases grain size and weight and reveals a TaSK41–TaSnRK1β1 module associated with carbohydrate metabolism in wheat
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本研究针对小麦籽粒大小和重量（千粒重）作为产量关键性状，但其调控网络特别是糖原合成酶激酶3（GSK3）信号与碳水化合物代谢间的互作机制尚不明确这一核心问题，研究人员聚焦于小麦中OsSK41的同源基因TaSK41，利用CRISPR/Cas9多基因编辑技术，成功创制了四个TaSK41拷贝同时失活的四重突变体。研究结果表明，TaSK41是籽粒大小和重量的负调控因子，其功能缺失能通过促进外果皮细胞增殖、提升生长素（IAA/IBA）水平和增强淀粉积累，从而显著增加粒重。更重要的是，研究首次揭示了TaSK41与能量感受激酶SnRK1的调控亚基TaSnRK1β1物理互作并促进其磷酸化，确立了TaSK41–TaSnRK1β1这一连接激酶信号与碳代谢的关键调控模块。该研究为解析小麦籽粒发育的分子机制提供了新见解，并为通过分子设计育种提高小麦产量潜力提供了重要的基因和单倍型资源。
小麦，作为全球最重要的主粮作物之一，其产量的稳定与增长直接关系到粮食安全。然而，面对不断增长的全球人口、频发的极端气候以及日益减少的耕地资源，提高小麦单产已成为一项紧迫挑战。在构成小麦产量的三要素——单位面积穗数、每穗粒数和千粒重（TGW）中，籽粒大小和重量因其较高的遗传力和表型稳定性，常被育种家们视为改良产量的重要靶标。尽管科学家们已经发现泛素化、生长素、油菜素内酯（BR）等多种信号通路参与调控籽粒发育，但一个关键的科学谜题依然悬而未决：这些复杂的信号网络是如何与籽粒灌浆过程中至关重要的碳水化合物代谢相“对接”的？特别是糖原合成酶激酶3（GSK3）/SHAGGY-like激酶家族成员，它们在植物生长发育中扮演多重角色，但其在小麦籽粒发育中的具体功能和分子机制，尤其是如何影响碳源分配，仍然知之甚少。
为了解开这个谜团，并寻找提高小麦产量的新途径，以张培培、杨德龙等研究人员为主的研究团队，将目光投向了水稻中的一个“明星”基因——OsSK41（也称OsGSK5）。该基因是调控水稻粒重和粒型的关键数量性状位点（QTL）qTGW3的编码基因，是一个已知的负调控因子。那么，它在小麦中的同源基因是否具有相似功能？其作用机制又是什么？围绕这些问题，研究团队在《The Crop Journal》上发表了一项系统性研究。
研究人员综合运用了多种关键技术方法展开探索。首先，通过生物信息学比对和分子克隆，他们在六倍体小麦中鉴定出四个TaSK41基因拷贝（TaSK41-1A, -4A, -5B, -5D）。随后，利用CRISPR/Cas9多重基因组编辑技术，成功培育了两个独立的四重突变体株系（task41-cr1和task41-cr2），实现了四个基因拷贝的同时功能缺失。研究还包含了细胞生物学分析（如外果皮细胞显微观察）、生理生化检测（淀粉、可溶性糖及生长素含量测定）、分子互作验证（酵母双杂交Y2H、双分子荧光互补BiFC、荧光素酶互补成像LCI、免疫共沉淀Co-IP及体内磷酸化分析）以及转录组学（RNA-seq）分析。此外，研究还利用了一个包含233份六倍体小麦种质的自然群体进行单倍型与性状的关联分析，以探究TaSK41基因的自然变异与农艺性状的关系。
3.1. 小麦中TaSK41基因的分离与序列分析
研究人员成功分离出四个TaSK41基因拷贝，它们与水稻OsSK41高度同源，均编码426个氨基酸的蛋白，并含有保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶结构域。系统发育分析显示这四个基因与OsSK41亲缘关系密切。
3.2. TaSK41基因拷贝的亚细胞定位与表达分析
亚细胞定位实验表明，TaSK41-5B蛋白同时定位于细胞质和细胞核。表达模式分析显示，所有四个TaSK41拷贝在幼穗和发育早期（如开花后5天）的籽粒中表达量最高，尤其在籽粒的果皮等母体组织中优势表达，这提示其功能可能与母体组织调控籽粒大小相关。
3.3. CRISPR/Cas9介导的TaSK41基因突变
研究团队设计了两条sgRNA，成功对四个TaSK41基因拷贝进行同步编辑，获得了两个纯合的四重突变体。测序证实这些突变导致了移码突变，预计使蛋白功能丧失。
3.4. TaSK41负调控小麦籽粒大小和重量
与野生型相比，两个四重突变体均表现出显著的表型变化：每穗粒数增加，籽粒更长、更宽、面积更大，千粒重（TGW）提升了12.1%至13.12%。同时，突变体籽粒中的淀粉含量显著升高。这些结果直接证明TaSK41是小麦籽粒大小和重量的负调控因子。
3.5. TaSK41敲除系外果皮细胞数量增加
细胞学分析发现，突变体籽粒在发育早期（15 DAA）的外果皮细胞数量显著多于野生型，而细胞长度无明显差异。这表明TaSK41主要通过抑制外果皮细胞的增殖来限制籽粒大小。
3.6. TaSK41与TaSnRK1β1发生物理互作并使其磷酸化
这是本研究的核心发现之一。通过酵母双杂交筛选，研究人员发现TaSK41与SNF1相关蛋白激酶1（SnRK1）的β调节亚基TaSnRK1β1存在互作。随后通过BiFC、LCI和Co-IP等实验在植物体内证实了二者的直接物理相互作用。更重要的是，Phos-tag凝胶 blot分析显示，TaSK41能够促进TaSnRK1β1在体内的磷酸化。这首次揭示了TaSK41–TaSnRK1β1这一将GSK3-like激酶信号与核心能量感受通路SnRK1联系起来的关键模块。
3.7. TaSK41通过调节植物激素途径、细胞壁重塑以及蔗糖和淀粉代谢影响籽粒大小
转录组分析显示，在task41突变体的发育籽粒中，大量与生长素信号、细胞壁重塑（如扩张蛋白基因）以及淀粉/蔗糖代谢相关的基因表达发生改变。同时，生理检测证实突变体籽粒中的生长素（IAA和IBA）水平显著升高，而可溶性糖（如蔗糖、葡萄糖）含量降低。这些变化与观察到的淀粉积累增加、细胞增殖增强的表型相一致，共同解释了籽粒增大的原因。
3.8. TaSK41-5B单倍型的关联分析与地理分布
自然变异分析发现，在四个拷贝中，TaSK41-5B存在与TGW显著相关的单倍型。研究人员开发了KASP分子标记，在233份小麦种质中鉴定出两种单倍型：TaSK41-5B-HapI和HapII。关联分析表明，携带HapI单倍型的小麦材料其TGW显著高于携带HapII的材料。有趣的是，表达分析显示HapI单倍型的TaSK41-5B表达水平较低，这与“TaSK41是负调控因子”的结论相吻合，表明HapI是利于提高粒重的优良等位变异。在中国主要麦区，HapI是优势单倍型。
研究结论与意义
综上所述，本研究系统阐明了TaSK41基因在小麦籽粒发育中的负调控作用。通过CRISPR/Cas9技术创制四重突变体，直接证明了敲除TaSK41能够协同增加每穗粒数和千粒重，打破二者常存在的权衡关系，从而显著提升产量潜力。在机制上，研究不仅验证了TaSK41与TaARF4互作的保守性，更重要的是首次发现了TaSK41与能量代谢中枢SnRK1的调控亚基TaSnRK1β1互作并促进其磷酸化，建立了TaSK41–TaSnRK1β1这一全新的调控模块。该模块将上游的激酶信号与下游的碳水化合物代谢和分配直接联系起来，为理解籽粒灌浆过程中信号转导与物质积累的耦合机制提供了关键分子线索。
此外，针对TaSK41-5B开发的分子标记及其与高产性状的关联，为小麦分子标记辅助选择（MAS）育种提供了切实可用的工具。因此，这项研究不仅深化了对小麦籽粒发育生物学基础的认识，而且从基因资源、分子机制和育种标记三个层面，为未来通过遗传改良策略定向提高小麦产量提供了重要的理论依据和实践方案。
