《Current Opinion in Biotechnology》：Beyond nature:
in vivo production of natural product analogues through programmed biosynthetic pathways
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本文深入阐述了利用合成生物学与人工智能技术，在工程化微生物宿主中高效、可编程地生产天然产物类似物的前沿进展。文章系统总结了异源途径组装、前体导向生物合成、理性酶工程及AI驱动的逆生物合成等核心策略，强调了该方法在克服传统化学合成挑战、拓展药物化学空间方面的巨大潜力。
超越自然：通过程序化生物合成途径体内生产天然产物类似物
新药发现的源泉正在经历一场深刻变革。传统天然产物（Natural Products， NPs）的发现率在20世纪90年代中期后显著放缓，而源自天然产物的衍生物却在新批准药物中占据重要地位。这凸显了天然产物类似物（NP analogues）——即结构上与天然产物相关，但不一定通过直接化学修饰获得的化合物——在新疗法开发，尤其是对抗抗生素耐药性中的巨大价值。然而，对高度复杂、功能密集的天然产物进行传统化学修饰，常面临冗长的多步操作、繁琐的中间体纯化和立体化学控制不佳等挑战。相比之下，在工程化微生物宿主中进行的体内生产，提供了一条极具吸引力的替代路径。
异源途径组装与前体导向生物合成
近年来，合成生物学的进步已成功将微生物宿主改造为多功能平台，能够实现复杂天然产物的从头生物合成与结构多样化，从而加速新疗法的发现。其核心策略是在异源宿主中精心重建复杂的天然产物途径，并利用途径的灵活性生成非天然的类似物。
建立稳健的异源途径后，多样化的策略便依赖于途径酶固有的宽泛底物特异性。前体导向生物合成（precursor-directed biosynthesis）是通过给工程菌株“喂养”替代底物来执行的。合理的底物设计可以引入非天然部分（如烷基链、卤素基团），在保持结构相似性的同时，优化药理性质或为后续化学修饰（如点击化学）提供可能。如果修饰后的底物能被酶促机制识别和处理，便可产生强效的非天然类似物。例如，通过喂养卤化酪氨酸衍生物，可以产生卤化的瑞枯灵（reticuline）类似物；喂养硒代半胱氨酸则产生了首个含硒唑的诺西肽（nosiheptide）衍生物。
这项多样化策略已在多个化学类别中取得丰硕成果。一项重大成就是在酵母中实现了皂苷佐剂QS-21的完全生物合成，这需要在异源宿主中组装一个包含38种酶的途径。该平台还通过利用酶的底物宽泛性，生成了与先进疫苗设计相关的结构类似物。此外，通过在酵母中建立主要大麻素的完全合成，并通过喂养不同脂肪酸产生类似物，实现了已知影响受体结合亲和力和效力的区域的结构修饰。在真菌米曲霉（Aspergillus oryzae）中，通过喂养修饰的芳香族前体生产了类萜类似物，其中一个类似物还表现出抗菌活性。
理性酶工程
天然产物类似物的多样化生产，很大程度上依赖于对关键生物合成酶的理性设计与改造。聚酮合酶（PKS）和非核糖体肽合成酶（NRPS）因其模块化和可编程性，成为酶工程的常见靶点。
针对PKS和NRPS的理性工程策略多种多样。例如，通过定点失活脱水酶域或删除整个PKS模块，可以产生羟基化衍生物和截短的巨内酯环，从而揭示其对抗癌细胞系的关键构效关系。通过酰基转移酶（acyltransferase）域交换，可以产生雷帕霉素（rapamycin）的23-去甲基类似物，该类似物与FKBP12-FRB形成的三元复合物稳定性降低，并在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中表现出减弱生长抑制作用，这凸显了通过理性药物调控的潜力。为了进一步扩大化学范围，在大肠杆菌（E. coli）中设计了一种氟选择性转酰基转移酶，使氟原子能够位点特异性地掺入聚酮骨架，将天然产物的复杂性与有机氟化学的药理优势相结合。
更为前沿的突破正在通过将非标准甚至非天然的化学成分直接整合到活细胞的生物合成机器中来扩展类似物生成的边界。一项研究通过在大肠杆菌中，将人工金属酶（artificial metalloenzyme, ArM）整合到天然代谢途径中，建立了一条混合生物催化路线：天然酶产生前体柠檬烯（limonene），然后由非生物来源的ArM催化自然界无法获得的环丙烷化反应，最终产生了一种新颖的、具有药物相关性的环丙基柠檬烯产物。这些研究展示了工程微生物正超越单纯的模仿自然，成为创造超越自然进化路径化合物的强大工具。
逆生物合成
逆生物合成（Retrobiosynthesis）旨在使用酶催化反应，从可用前体反向设计出所需的目标化合物，通常设计完全人工的途径来生产自然界（尚）不存在的化学物质。
计算工具对于克服生物合成途径设计中的瓶颈至关重要，特别是在识别新的酶功能和预测途径可行性方面。机器学习赋能的逆生物合成平台现在能够预测和排序通向非天然目标的多步骤酶促路线，同时评估热力学可行性以优先考虑可实施的设计。酶选择则通过序列挖掘、功能预测以及利用酶底物宽泛性的模型来加强，使用活性位点相似性、分子对接/动力学得分和序列-活性模型等对候选酶进行优先排序。集成的AI框架将逆合成搜索与基于约束的模型和热力学分析相结合，用于端到端的途径规划。
逆生物合成已直接应用于设计人工代谢途径。例如，基于逆合成分析，研究人员利用酶的底物宽泛性并改造宿主核心代谢以供应前体，在大肠杆菌中首次成功实现了4,6-二羟基香豆素（4,6-DHC）的微生物生产。同样，逆生物合成也被用于重编程fluvirucin PKS途径，构建了δ-戊内酰胺（δ-VL）及其δ-取代类似物的微生物生产途径。
结论与展望
本文综述的研究强调了体内生产天然产物类似物作为克服传统药物发现局限性的关键策略。随着新天然产物骨架的发现速度放缓以及抗生素耐药性等临床挑战加剧，快速、选择性地生成新类似物的能力变得至关重要。目前，通过在酵母和大肠杆菌等工程宿主中重建生物合成途径所取得的成功，通常展现出优于传统化学合成的区域和立体选择性以及更广泛的官能团耐受性，从而规避了冗长多步操作和严重依赖保护基策略的问题。这种方法有效利用了细胞的天然机制，包括必需的辅因子和代谢物，为卤化生物碱和功能化绿脓菌素（pyoverdine）等复杂分子建立了高效、可定制和可持续的生产路线。
展望未来，与计算技术的融合有望加速这一领域的进展。人工智能，特别是机器学习模型，将通过实现快速基因组挖掘、预测新的酶促转化以及以前所未有的速度指导途径工程，彻底改变生物合成途径的设计和优化。这些工具可以进一步将过程从试错转向理性设计，降低天然产物类似物开发的复杂性。然而，从概念性途径设计到稳健的体内生产，仍受到一些实际因素的限制，包括对异源宿主造成的代谢负担、途径中间体的毒性、代谢物运输和区室化的限制以及分析通量的瓶颈。此外，对酶特异性和环境依赖性行为的理解不完全，仍会带来难以通过计算预测的不确定性。因此，该领域的进步不仅取决于人工智能驱动预测的发展，还依赖于宿主工程、实验通量和迭代设计-构建-测试-学习周期的并行发展。尽管如此，我们预计合成生物学与计算工具的融合，将成为可持续、快速供应治疗相关化合物的推动力，确保继续探索新的化学空间以应对新发疾病。
附：代表性天然产物及其类似物
