综述：微生物木质素降解及木质素衍生芳香化合物升级再造的最新进展

《Current Opinion in Biotechnology》：Recent advances in microbial lignin degradation and upcycling of lignin-derived aromatic compounds

本文系统总结了微生物木质素转化领域的最新研究进展，聚焦木质素解聚、芳香化合物代谢和产物合成三大关键步骤。内容涵盖高效木质素氧化酶及辅助酶系的发现与优化，木质素二聚体和单体代谢新机制与调控网络的解析，以及通过代谢工程与适应性实验室进化构建高效微生物底盘，实现从木质素到高附加值产品（如香兰素、cis,cis-粘康酸、聚羟基链烷酸酯等）的生物合成路线。为推进木质素生物炼制，构建可持续的生物基循环经济提供了全面视角与技术工具。

　　

木质素是地球上主要的可再生芳香化合物来源，但其结构的复杂性和顽固性是实现高效解聚与升级再造的巨大挑战。近年来，微生物木质素转化技术因其环境友好的特点而备受关注。本综述聚焦该领域的最新进展，系统梳理从木质素解聚到最终产品合成的完整链条。

木质素解聚

自然界中，木质素的解聚主要由微生物群落驱动。关键的木质素降解酶类，如木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶、染料脱色过氧化物酶（DyPs）和漆酶，通过可扩散的小分子介体氧化木质素的化学键。生物芬顿反应产生的羟基自由基也是一种强氧化剂。高效的木质素降解依赖于解聚酶和辅助酶的共同作用。醌氧化还原循环通过产生活性氧并防止醌介导的木质素再聚合，增强了木质素分解活性。在真菌中，葡萄糖脱氢酶、纤维二糖脱氢酶和苯醌还原酶等酶类通过还原醌参与此循环。此外，作用于木质素分解产生的醇和醛的芳基醇氧化酶和醛氧化酶为细胞外提供了必需的H₂O₂。

木质素衍生芳香化合物的代谢

木质素衍生二聚体的降解

木质素二聚体是阐明微生物降解途径的重要模型化合物。其中，β-O-4（β-醚键）二聚体芥子醇-β-愈创木基醚的代谢途径在Sphingobium lignivorans SYK-6中研究较为清楚，涉及Cα-脱氢酶和谷胱甘肽S-转移酶。随机条形码转座子插入测序技术扩展了我们对联苯二聚体脱氢香草酸降解相关基因功能的认知。对于β-1型（螺二烯酮）二聚体和β-5型（苯基香豆满）二聚体，新近研究也揭示了其独特的开环与转化机制。

木质素衍生单体的降解

单体的上通道代谢涉及O-脱甲基化、羟基化、磷酸化和脱羧等反应，将各种芳香结构汇聚成关键的中心儿茶酚类中间体，如原儿茶酸、儿茶酚和没食子酸。其中，O-脱甲基化因其是大多数木质素单体的限速步骤而备受关注。该过程主要由Rieske非血红素铁加氧酶和细胞色素P450单加氧酶催化。近期研究表明，通过H₂O₂隧道工程和人工过氧化物酶系统的开发，可显著提升芳香族O-脱甲基化的催化效率。此外，部分细菌利用四氢叶酸依赖的O-脱甲基酶进行非氧化性脱甲基，该过程不产生有毒的甲醛或甲醇。

单体代谢效率还受到辅助系统的制约。例如，在代谢G型和S型单体时，需要对甲醛等副产物进行解毒。适应性实验室进化产生的Pseudomonas putida KT2440菌株，通过vanB、全局调控因子和参与甲醛解毒的甲酰谷胱甘肽水解酶基因fghA的突变，增强了其在香草酸上的生长能力。

木质素衍生芳香化合物的转运与调控

微生物对木质素衍生芳香化合物的分解代谢需要跨膜转运，这通常是生物转化中的限速步骤。虽然小的疏水分子可以被动扩散，但大多数芳香酸需要专门的转运系统，例如主要协助转运蛋白超家族、ATP结合盒转运蛋白等。在Pseudomonas putida中，过表达编码原儿茶酸转运蛋白的pcaK基因，可将原儿茶酸的利用率提高八倍。

高效的分解代谢还依赖于基因表达的精密调控。转录调控因子通常响应特定的芳香底物或中间体。例如，在Sphingobium lignivorans SYK-6中，MarR型调控因子DdvR以脱氢香草酸为诱导物，调控DDVA降解途径。这些调控因子及其同源启动子已成为设计合成调控回路、构建高效生物催化剂和开发全细胞生物传感器的宝贵工具。

向目标产物的转化

微生物能够将木质素衍生芳香化合物转化为多种高附加值产品。

芳香族化合物

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  原儿茶酸：作为一种具有药用价值、可作为生物聚合物前体的关键化合物，在工程化P. putida KT2440中，通过删除pcaGH基因并调整酶表达，实现了从H型和G型芳香化合物生产原儿茶酸。
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  香兰素及其衍生物：香兰素是一种高价值的香料化合物。通过工程化改造，在P. putida KT2440中，通过设计天然CoA依赖的非β-氧化途径、删除竞争性醛脱氢酶和香兰素还原酶基因，并结合原位树脂吸附回收，实现了从阿魏酸到香兰素的高效转化。
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  吡啶二羧酸：作为石油衍生邻苯二甲酸的生物基类似物，是再生聚酯的有前途的单体。通过在Rhodococcus jostii RHA1和P. putida KT2440中阻断天然的β-酮己二酸途径并表达异源的原儿茶酸间位裂解酶，实现了从木质素衍生化合物生物合成吡啶二羧酸。
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  2-吡喃酮-4,6-二羧酸：这是一种高性能生物基聚合物关键的假芳香前体，目前仅能通过微生物发酵生产。在多种工程菌株中，通过代谢途径的优化与改造，已实现了从香草酸、丁香酸乃至木质素二聚体高效生产2-吡喃酮-4,6-二羧酸。

非芳香族化合物

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  cis,cis-粘康酸：作为一种重要的平台化学品，在多种工程菌株中实现了从儿茶酚或木质素衍生单体（如香草酸、阿魏酸）的生物合成。改造策略包括替换辅因子依赖型酶、优化辅因子平衡以及引入新的代谢途径。
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  β-酮己二酸：作为尼龙-6,6类似物的单体，在工程化的P. putida KT2440中，通过增强4-羟基苯甲酸羟基化和香草酸O-脱甲基化，同时删除降解基因，实现了高效生产。
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  聚羟基链烷酸酯：通过系统生物学和代谢工程策略，已成功将木质素衍生芳香化合物转化为生物可降解塑料聚羟基链烷酸酯。研究涉及在P. putida中重定向碳通量，以及利用Halomonas菌株直接从漆酶预处理的木质素生产聚羟基丁酸酯。
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  类胡萝卜素：重组Novosphingobium aromaticivorans菌株在以香草酸或碱预处理高粱生物质生长时，能够积累类胡萝卜素和辅酶Q₁₀等亲脂性化合物。

结论与展望

木质素降解微生物和酶的性能仍有局限，而关于辅助酶和醌氧化还原循环作用的新认知对于改进木质素解聚至关重要。高通量筛选、适应性实验室进化和机器学习指导的蛋白质工程等新兴工具，为发现和优化更稳定、底物谱更广的酶提供了有前景的途径。

微生物对木质素衍生芳香化合物的代谢依赖于多样化的转运系统、酶网络和调控回路，目前对其理解仍不全面。识别未被充分利用的木质素单体的新汇聚途径，对于提升木质素衍生芳香化合物的价值至关重要。近期的代谢工程和适应性进化策略优化了木质素生物加工中的氧化还原平衡与能量需求。通过生物铸造厂驱动的设计-构建-测试-学习循环开发的合成遗传回路和下一代微生物底盘，使得在单细胞或合成菌群中整合解聚与转化途径成为可能。然而，将这些进展转化为工业规模仍然是一个重大挑战。