《PLOS Biology》：Neurofilament light chain may serve as a cross-species blood biomarker to assess aging and predict mortality
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本研究首次大规模验证了神经丝轻链(NfL)作为一种在人类及多种哺乳动物（小鼠、猫、狗、马）中随年龄增长而显著升高的血液生物标志物，并证明其在老年小鼠中升高的速率能有效预测个体剩余寿命。这些发现提示，NfL有望成为衡量神经衰老进程和评估抗衰老干预效果的跨物种通用指标，具有重要的转化医学与兽医学应用前景。
摘要
神经丝轻链(NfL)是一种在中央和周围神经系统神经元中表达的蛋白，其血液水平升高与神经元损伤和神经退行性疾病相关。有趣的是，即使在无已知神经系统疾病的健康人群中，NfL水平也随年龄增长而增加，并已被证实能预测全因死亡率。为了探究NfL随年龄增长这一关系是否在其他物种中同样保守，本研究分析了多种动物的血液NfL水平。结果表明，NfL水平的年龄相关性增长在小鼠、猫、狗和马中均与人类观察到的情况相似。对老年小鼠NfL轨迹的纵向分析进一步证明，NfL水平的增速加快能够预测死亡率。在比较13个物种的基线NfL水平时，研究发现基线NfL水平较低的物种往往寿命更长，尽管体型与寿命之间的共线性使得这一发现的解释变得复杂。此外，研究还在其他39种哺乳动物以及少数爬行动物和鸟类的血液中稳定检测到了NfL，这与血液中NfL片段的氨基酸序列高度保守的发现一致。鉴于NfL作为人类神经健康和死亡率生物标志物的研究日益增多，本研究结果提示，NfL可能作为一种跨物种血液生物标志物，用于评估衰老干预措施和预测死亡率。
引言
神经丝轻链(NfL)与神经元损伤及神经退行性疾病相关，但在无神经疾病的健康人群中，其水平亦随衰老而上升。已有研究将NfL水平与百岁老人及非百岁老人的全因死亡率风险增加联系起来，并在以年轻群体为主的基于人群的研究中，将其确立为全因死亡率的预后标志物。为探究NfL的年龄相关性增长是否在其他物种中具有普遍性，本研究利用“单分子阵列”(Simoa)技术检测了多种动物的血液NfL水平，并在老年小鼠中进行了纵向血液采样，以检验NfL对死亡的预测能力。
结果
样本采集
本研究共获取了来自57个物种、总计862只动物的血液样本，来源包括商业和学术兽医诊断实验室、当地动物园以及Hertie临床脑研究所。排除了已知存在神经损伤证据的血液样本。此外，还测量了饲养于Hertie临床脑研究所的老年小鼠的纵向血液样本中的NfL水平。作为对照，分析中还纳入了一项近期发表的人类年龄队列的血液NfL测量数据。
年龄相关性增长
为了确定不同物种中NfL水平与年龄的关系，研究首先根据已知物种平均寿命，将动物（小鼠、猫、狗、马）和人类样本分为三个关键生命阶段：青年、成年和老年。结果显示，在所有物种中均观察到与年龄相关的NfL升高，具体表现为：马的NfL水平随年龄增长约升高3倍，人类约7倍，小鼠和狗约14倍，而猫则高达36倍。性别差异（在信息可获取的范围内）不显著。
为了研究不同物种中NfL随年龄变化的轨迹，研究将基线NfL测量值建模为衰老的函数。在所有四种动物物种中，均观察到与人类相似的非线性关联和年龄轨迹。这些轨迹的特点是成年期增长缓慢，而在生命末期急剧上升。
NfL轨迹预测死亡率（小鼠纵向研究）
虽然对大多数物种无法进行纵向血液测量和直至死亡的追踪，但本研究在实验室条件下追踪了一个独立的C57BL/6J小鼠队列。这使我们能够评估个体内NfL随衰老的变化。在小鼠19-20月龄、一个月后、23-24月龄以及再一个月后共采集了四次纵向血液样本。通过线性混合效应模型计算出的NfL浓度变化率（斜率；ΔNfL）与剩余寿命呈负相关。根据NfL斜率是高于还是低于均值（62.587 pg·ml?1·month?1）将小鼠分为两组，并进行Kaplan-Meier生存分析，结果显示两组之间存在显著分离，斜率较低的小鼠生存期更长。随后的Cox回归分析表明，NfL斜率每增加一个标准差，死亡风险相应增加73.5%（若纳入性别因素则为69.1%）。
基线NfL水平与物种寿命及体重的关系
研究将分析扩展到更多物种。除了人类之外，还对另外12个物种的青年动物（至少有5个样本）进行了NfL测量。研究发现不同物种间的基线NfL水平存在显著差异，寿命较长的物种倾向于具有较低的NfL水平，尽管这种关联并不显著。
鉴于人类研究中已显示体重与NfL水平相关，研究还比较了NfL水平与物种平均体重的关系。结果再次揭示了基线NfL水平与体重之间的负相关关系。为了在相关性分析中考虑体重的差异，研究测试了两种模型：NfL/体重 ~ 最大寿命，以及 NfL ~ 最大寿命 + 体重。然而，当前数据集中体重与寿命的高度相关性很可能解释了第一个模型中观察到的强相关性。
NfL检测的广泛性与序列保守性
研究还在另外39种哺乳动物的血液中检测到了NfL。一致的是，对于本研究所用免疫测定法至关重要的NfL表位的氨基酸序列在所有已公开序列的物种中都显示出高度的保守性。尽管在检查的每一个哺乳动物血液样本中均能检测到NfL，但在爬行动物和鸟类中检测率较低（例如，在48只龟鳖类动物中仅5只检测到，6条蛇中1条，1条鳄鱼，19只蜥蜴中3只，4只鸟中1只）。这些在爬行动物和鸟类中的测量结果可能是假阳性，但同样可能的原因是健康爬行动物和鸟类的NfL水平低于当前免疫测定法的检测限。
讨论
研究意义
本研究发现，在所有可获得全年龄段血液样本的物种中，NfL均呈现显著的年龄相关性增长。此前已有研究在狗和成年牛中观察到年龄相关的NfL增加。本研究数据还表明，老年小鼠的NfL轨迹可以预测死亡率，这与在老年人类中的报道一致。
样本与健康状态
由于送到兽医诊断实验室的样本性质，许多血液样本可能来自健康状况未知的动物，这可能会影响NfL水平。然而，预计这种未知的健康问题在送到诊断实验室的所有年龄组样本中发生的几率是均等的。此外，在分析衰老和基线NfL时，使用中位数来平滑由个体健康问题引起的差异。
NfL与死亡率及神经退行性疾病
在人类中，NfL的年龄相关性增长不仅能预测神经退行性疾病的进展，也与老年队列的全因死亡率相关。大型血液蛋白质组学研究也已将NfL确定为预测/关联死亡率的关键蛋白之一，这提示死亡率与衰老神经系统之间存在联系。虽然有人认为潜在的亚临床神经退行性疾病可能是驱动人类NfL水平与死亡率关联的因素，但人类所知的神经退行性疾病在动物中较为罕见。重要的是，本研究中使用的C57BL/6J小鼠并未表现出任何人类神经退行性疾病的核心病理特征。这表明，NfL变化速率的加快能够独立于潜在的亚临床神经退行性疾病预测死亡。
基线NfL的种间差异与潜在机制
哺乳动物血液中基线NfL水平的差异显示出与体型和寿命的负相关关系，但这两个因素之间的共线性使得解释变得困难。物种间基线NfL水平的差异可能反映了脑/体重比——更大的大脑含有更多NfL，而脑源性NfL在更大的身体中被更稀释。然而，尽管小鼠和人类的脑体重比相似，我们观察到基线（中位数）NfL浓度存在7.4倍的差异。NfL也是周围神经系统的一个组成部分，其相对于体型的缩放关系尚不清楚。
另一种可能的解释是，基线NfL水平可能更贴近物种特异性的代谢差异。体型较小的动物通常代谢率更高，神经元更新更快，这可能促进了钙蛋白酶介导的神经元NfL释放。这种解释与我们之前的发现一致，即饮食限制的动物NfL水平较低，这与饮食限制的动物和人类代谢率降低相符。这也可能解释了为什么尽管血液NfL片段序列总体同源，但仅在少数爬行动物物种中能检测到NfL水平。解决此类机制问题的一种可能性是评估那些偏离哺乳动物典型体重-寿命相关性的物种（例如裸鼹鼠、蝙蝠）的NfL水平。
序列保守性与潜在机制
血液NfL片段在物种间的序列保守性表明，神经元NfL释放入血液是一个进化上保守的过程。对于小鼠，已有研究提示钙蛋白酶介导的NfL释放，以及分泌的NfL片段会激活免疫（小胶质细胞），而许多物种中常见随衰老发生的小胶质细胞激活。一种保守的NfL介导的免疫机制是一个令人兴奋的可能性，并将推动NfL作为神经衰老的跨物种生物标志物。
应用前景
当前的研究发现为NfL测量的更广泛应用打开了大门。它们证明了使用NfL作为生物标志物来追踪非人类物种的神经健康并评估潜在的衰老干预措施的可行性，在兽医学中具有潜在应用价值。
方法
动物与血液样本
动物血液样本来自兽医诊断实验室、苏黎世大学临床诊断与服务部以及当地动物园的生物样本库。绝大多数样本为血清，其余为血浆样本。小鼠血浆样本来自Hertie临床脑研究所的小鼠生物样本库。人类血浆样本的使用已获得德国图宾根大学医学院伦理委员会的批准。小鼠血浆的采集符合德国巴登-符腾堡州兽医办公室的规定，并得到了当地动物护理和使用委员会的批准。
老年小鼠的纵向血液采集与终生监测
对于老年C57BL/6J小鼠的纵向血液采样，每次采集不超过总血容量的10%。小鼠通过异氟烷麻醉，通过穿刺眶后窦用毛细管采集血液至抗凝管中。采集后，每周多次观察小鼠直至其自然死亡或达到人道终点。人道终点在研究开始前确定，预期反映接近自然死亡的时间点。评估标准包括外观、姿态与活动、营养状况以及临床和实验特异性体征，并进行评分。一旦总分达到8分或以上，动物即被实施安乐死。
NfL测量
储存于-80°C的血浆和血清样本在湿冰上解冻一小时。随后混合并离心。使用单分子阵列平台和市售检测试剂盒进行测量。所有样本均进行复孔检测并取平均值。根据Simoa NfL检测中使用的内部人脑脊液对照样本，使用NF-Light v2 Advantage Kit测得的结果乘以系数1.44，以便与NF-Light Advantage Kit的NfL结果相匹配。除少数样本外，所有样本的变异系数均小于20%。
统计分析
数据排除
排除了来自非常年幼动物（处于其平均寿命前5%）的样本，因为有人类和犊牛的报告称NfL在出生后早期阶段会升高。此外，还排除了一批1岁的猫和狗的样本，因为其确切年龄不确定。在相关图表中，还因年龄数据缺失或超出相应物种的青年年龄范围而排除了其他样本。
数据转换
由于文献中关于血浆和血清样本NfL浓度的发现存在矛盾，本研究将血浆中的NfL浓度与血清中的NfL浓度按1:1的比例同等对待。小鼠、猫、狗、人类和马的绝对NfL水平不呈正态分布，因此在衰老分析前进行了log10转换。
血液NfL纵向分析与死亡率预测
为了确定个体内NfL的平均月变化率，拟合了一个线性混合效应模型，以时变的NfL为因变量，时变的年龄为固定效应，并包含每只小鼠的随机截距和斜率。提取个体斜率估计值用于下游分析。剩余生存时间计算为每只小鼠最后一次NfL测量时的年龄与其死亡年龄之间的时间。应用线性回归拟合来检验剩余生存时间作为ΔNfL的函数。对于Kaplan-Meier生存估计，根据个体的ΔNfL是高于还是低于队列平均值对队列进行分层。对于多变量Cox比例风险回归分析，在拟合每个预测因子之前，使用scale函数对ΔNfL进行z标准化。
其他统计方面
使用RStudio、Prism 10或Microsoft Excel进行模型、统计和计算。对于部分图表，研究者有意避免检测可能的离群值，因为大多数数据集非常小，明显的离群值可能只是反映了真实的生物变异。移除它们可能会带来偏倚风险，这是研究者希望避免的。统计显著性设定为p < 0.05，并对多重检验进行了校正。为了便于视觉解读，使用了带三次样条的广义加性模型来绘制每个物种的NfL随年龄变化的函数。应用线性回归拟合来检验各物种NfL的年龄相关变化。使用非参数Spearman相关进行青年动物基线NfL水平与体重或最大年龄之间的相关性分析。所有数值均以中位数±95%置信区间表示。
