SOX9 是一个组合标记物的一部分，该标记物能够揭示小鼠棕色脂肪组织储存区的早期发育过程及其胚胎学起源

《Developmental Biology》：SOX9 is part of a combinatorial marker that reveals early development and embryological origins of the mouse brown adipose tissue depots

本研究通过形态学标记和SOX9表达定位小鼠三种褐脂组织（iBAT、sBAT、cBAT）的胚胎起源，发现iBAT和sBAT起源于Pax7+真皮肌层，而cBAT起源于Pax7阴性区域。利用新型SOX9标记组合结合转录组分析，揭示了早期褐脂前体细胞的分化轨迹及调控机制。

　　

作者：Ava E. Brent、Rika Chan、Vaishnavi Sirkay、Brian R. Morton、Jennifer H. Mansfield

哥伦比亚大学生物科学系，纽约州纽约市

摘要

棕色脂肪组织（BAT）是一种产热组织，有助于维持体温并发挥重要的代谢功能。大多数棕色脂肪细胞位于称为脂肪库的结构中，其发育起源尚未完全阐明。在这里，我们利用形态学标志物和SOX9转录因子的表达来确定三种主要小鼠BAT脂肪库的胚胎位置。通过免疫荧光和遗传谱系追踪发现，SOX9在棕色脂肪细胞前体从真皮肌节中分离出来时开始表达。谱系追踪还证实了最大的脂肪库——肩胛间BAT（iBAT）起源于Pax7阳性的真皮肌节，并表明肩胛BAT（sBAT）具有类似的胚胎起源，而颈部BAT（cBAT）则来源于Pax7谱系之外的体节。最后，我们使用SOX9作为新的组合标记物，分析了早期棕色脂肪细胞前体和前脂肪细胞的转录组，揭示了包括旁分泌信号环境在内的相关途径，这些途径可能是主要脂肪库中棕色脂肪细胞形成的关键因素。我们的研究结果有助于理解这种新型哺乳动物组织的最早发育阶段。

引言

棕色脂肪组织（BAT）是哺乳动物特有的产热组织。在大多数物种中，BAT是非颤抖性产热的主要来源；它能够维持体温，包括在寒冷压力下，并在发热反应和从冬眠中醒来时升高体温（参见Cannon & Nedergaard, 2004; Oelkrug et al., 2015）。越来越多的研究表明，BAT还具有代谢和内分泌作用。活跃的棕色脂肪细胞会氧化储存在细胞内的脂质，并通过将线粒体质子梯度与ATP合成解偶联来产生热量。因此，BAT的活动会降低整体代谢效率，其活性和扩张受到中枢调控，被认为会影响许多生理过程和医学状况，包括糖尿病和肥胖症。在成年人类中，尽管BAT脂肪库的规模远小于婴儿时期，但据估计约占基础代谢率的5%（van Marken Lichtenbelt & Schrauwen, 2011）。

棕色脂肪细胞分布在全身的白色脂肪组织中，以及一些内脏器官和血管周围的小型脂肪库中。然而，大多数棕色脂肪细胞位于躯干和颈部的大型双侧脂肪库中，靠近心脏和主要血管。这些脂肪库被认为具有全身性保暖功能。在啮齿动物和人类中，iBAT是最大的脂肪库，位于肩胛骨内侧后方，靠近背部和胸肌。一条大血管（啮齿动物中的Sulzer静脉）穿过iBAT并将加热后的血液输送回心脏（Oelkrug et al., 2015）。sBAT（也称为腋下或肩胛下BAT）形成于肩胛骨深处，被认为通过锁骨下静脉和颈静脉将加热后的血液输送回心脏。cBAT位于颈椎外侧后方，靠近向大脑供血的颈动脉和椎动脉（Hachemi & U-Din, 2023; Sacks & Symonds, 2013）。

BAT的胚胎起源及其形成机制尚未完全了解。小鼠的遗传谱系追踪显示，大多数BAT来源于体节。体节是短暂的胚胎结构，会生成包括大部分骨骼肌在内的肌肉骨骼衍生物，以及轴向骨骼及其相关结缔组织（参见Brent & Tabin, 2002）。体节最初以两侧的上皮球形式出现，随后分裂为软骨和骨骼形成的背侧腔室（sclerotome）和产生骨骼肌前体的腹侧腔室（myotome），以及产生真皮前体的背侧腔室（dermomyotome）。谱系追踪还表明，真皮肌节也会产生棕色脂肪细胞（Lepper & Fan, 2010; Sanchez-Gurmaches & Guertin, 2014; Sebo et al., 2018; Sebo & Rodeheffer, 2019）。很可能正是位于BAT脂肪库形成区域的体节产生了大部分棕色脂肪细胞，尽管这一点尚未得到验证。

围产期和成年期的iBAT棕色脂肪细胞会表达Meox1（一种体节特异性标记物），以及Pax7、Pax3、En1和Myf5，这些标记物共同表明它们起源于中央和肩胛骨内侧的真皮肌节（Atit et al., 2006a; Lepper & Fan, 2010; Sanchez-Gurmaches & Guertin, 2014; Seale et al., 2008; Sebo et al., 2018）。sBAT也来源于表达中央和肩胛骨内侧真皮肌节标记物的细胞（Atit et al., 2006a; Lepper & Fan, 2010; Sanchez-Gurmaches & Guertin, 2014）。这一体节区域还产生背侧骨骼肌和真皮。大多数cBAT脂肪细胞被Pax3-Cre标记，但与iBAT或sBAT不同，只有约60%的cBAT脂肪细胞被Myf5-Cre标记（Sanchez-Gurmaches & Guertin, 2014）。因此，目前认为主要BAT脂肪库中的棕色脂肪细胞主要或完全来源于真皮肌节，尽管也可能有其他来源。

棕色脂肪细胞谱系分化的时间和机制在体内胚胎阶段仍不完全清楚。这在一定程度上是由于缺乏早期分子标记物，尽管已经取得了很大进展。上述谱系标记表明，棕色脂肪细胞、骨骼肌和背侧真皮具有共同的前体——真皮肌节。在这三种细胞类型中，真皮成纤维细胞最早发生谱系分化，这基于它们终止Pax7表达的时间（Lepper & Fan, 2010），并且这一结论得到了Pax7谱系scRNA-seq分析的支持（Fung et al., 2022）。真皮成纤维细胞的命运受到上方表皮Wnt信号的影响（Atit et al., 2006a）。iBAT的棕色脂肪细胞前体在胚胎第12.5天之前终止Pax7表达（Lepper & Fan, 2010）。最近的研究发现，GATA6在胚胎脂肪库形成和iPS细胞分化过程中都能促进棕色脂肪细胞的命运（Jun et al., 2023; Rao et al., 2023）。相反的转录回路参与了棕色脂肪细胞与骨骼肌命运的区分（参见W. Wang & Seale, 2016）。

在小鼠iBAT脂肪库中，早在胚胎第12.5天，就可通过全胚胎mRNA原位杂交检测到棕色脂肪细胞前体，使用的是脂肪细胞标记物Pparg、Cepba和Fabp4，以及通过切片免疫荧光检测GATA6（Jun et al., 2023; Mayeuf-Louchart et al., 2019; Rao et al., 2023）。scRNA-seq显示，Gata6阳性的棕色脂肪细胞来源于E11.5-E12.5期间存在的多能成纤维细胞前体群体（Jun et al., 2023; Rao et al., 2023）。这项工作显著推进了对早期iBAT发育的理解。然而，sBAT和cBAT的研究较少，且任何主要脂肪库的最早发育阶段都尚未被可视化。为了了解脂肪库的发育环境以及调控其形成的局部细胞和组织相互作用，有必要表征棕色脂肪细胞前体的空间和时间出现情况。

在这里，我们根据Meox1的表达历史确定了三种主要BAT脂肪库的胚胎位置。进一步研究表明，SOX9转录因子在所有三种脂肪库中都能标记棕色脂肪细胞前体和前脂肪细胞，其在iBAT和sBAT中的表达始于胚胎第11.5天之前，在cBAT中则更早。这种新的早期棕色脂肪细胞前体标记物通过免疫荧光和条件性遗传谱系追踪得以可视化，表明SOX9的表达比其他已知标记物更早地在棕色脂肪细胞前体中激活，从而有助于观察脂肪库形成的早期阶段。Pax7的条件性谱系标记结合SOX9表达可以用来可视化iBAT和sBAT形成区域中早期棕色脂肪细胞前体的位置。相比之下，cBAT脂肪库起源于Pax7真皮肌节域之外，并且更早激活SOX9，表明其具有不同的发育起源。scRNA-seq和轨迹分析表明，棕色脂肪细胞前体正在传递与局部环境相关的信号，并确定了体内棕色脂肪细胞形成的关键驱动因素。

小鼠品系、繁殖和他莫昔芬给药

使用了以下小鼠等位基因：Rosa26tdTomatoo Cre报告基因：B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm9(CAG-tdTomato)Hze/（Madisen et al., 2010），Jax品系#007909；Meox1Cre：Meox1tm 1(cre)Jpa（Jukkola et al., 2005）；PaxCre/ERT2：B6.Cg-Pax7tm1(cre/ERT2)Gaka/J（Murphy et al., 2011），Jax品系#017763；Sox9Cre/ERT2：C57BL/6-Sox9em1(cre/ERT2)Tchn/J（Xu et al., 2015），Jax品系#035092。为了生成胚胎，携带Cre等位基因的雄性与携带报告基因的纯合雌性小鼠进行交配。

结果

成熟小鼠iBAT、sBAT和cBAT脂肪库沿AP和DV轴的解剖位置在图S1A中示意。通过E14.5时的免疫荧光可以观察到这些脂肪库（图S1B），而最早的分化迹象（如脂滴形成）可以在E15.5时检测到（Mayeuf-Louchart et al., 2019）。在E12.5时，通过全胚胎原位杂交可以检测到前脂肪细胞标记物的mRNA（

SOX9作为体内棕色脂肪细胞前体和前脂肪细胞的新组合标记物

SOX9能够维持多种细胞类型的增殖和未分化状态（参见Lefebvre et al., 2007）。已知它在白色前脂肪细胞中发挥这一功能，直接抑制泛脂肪细胞转录调节因子Cebpb和Cebpd（Gulyaeva et al., 2018; Y. Wang & Sul, 2009）。我们发现，在体内棕色脂肪脂肪库形成过程中，SOX9同样标记棕色脂肪细胞前体和前脂肪细胞，并且其表达早于mRNA或蛋白质的表达（

CRediT作者贡献声明

Rika Chan：可视化、方法学、研究、数据整理、概念构建。Ava E. Brent：写作——审稿与编辑、写作——初稿、可视化、方法学、研究、概念构建。Brian Morton：可视化、监督、方法学、研究、概念构建。Vaishnavi Sirkay：可视化、方法学、研究、概念构建。Jennifer Mansfield：写作——审稿与编辑、写作——初稿、可视化、监督，

未引用参考文献

Ahmed et al., 2017; Atit et al., 2006b; Ben-Yair et al., 2003; Ben-Yair and Kalcheim, 2005; Boon et al., 2013; Christ et al., 2007; Elsen et al., 2014; Gros et al., 2005; Hachemi and U-Din, 2023; Jun et al., 2023; Relaix et al., 2005; Tseng et al., 2008.

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本研究得到了美国国家科学基金会（NSF）的资助（项目编号：IOS-2019537）。本研究中使用的Barnard学院共聚焦显微镜也得到了NSF的资助（项目编号：DBI-1828264）。我们感谢参加2021-2022年和2023-2024年“分子遗传学项目实验室”课程的学生（Barnard学院）对试点scRNA-seq数据的分析，以及Lucie Jeannotte、Jean Charron及其实验室（拉瓦尔大学）对这些试点分析的讨论。我们还要感谢