《PLOS Pathogens》：Toxoplasma gondii GRA3 activates interferon-stimulated genes and STAT6 by the cGAS-STING pathway to promote parasite proliferation
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本文揭示了弓形虫（Toxoplasma gondii）效应蛋白GRA3如何通过靶向宿主STING分子，激活下游cGAS-STING-TBK1-IRF3通路，促进IRF3介导的干扰素刺激基因ISG56表达以及STAT6磷酸化，最终增强虫体增殖，从而精细调控宿主免疫应答，有利于其建立慢性潜伏感染的新机制。
摘要
弓形虫（Toxoplasma gondii）是一种广泛存在的专性细胞内寄生虫，能够感染几乎所有温血动物。在免疫力正常的人群中，感染通常是无症状的，但免疫功能低下者可发展为严重的弓形虫病。宿主通过产生I型干扰素（如IFN-β）等关键免疫分子来防御弓形虫感染，但弓形虫也进化出多种策略来操纵宿主免疫防御。本研究聚焦于GRA3，一种在低毒力ME49株系中高表达的蛋白质。我们发现，GRA3与宿主蛋白STING相互作用，激活cGAS-STING信号通路，导致ISG56、p-STAT6和IFN-β的产量增加。有趣的是，与抑制寄生虫的IFN-β不同，ISG56和p-STAT6反而增强了弓形虫的增殖。我们的发现揭示了弓形虫如何通过精细调控宿主免疫反应，在激活与逃逸之间取得平衡，促进慢性潜伏感染的建立。
引言
弓形虫是全球范围内一种重要的人畜共患细胞内寄生虫，感染率极高。根据其毒力，弓形虫主要分为三个克隆谱系：高毒力的I型株（如RH和GT1）、低毒力的II型株（如ME49和PLK）和无毒的III型株（如CEP）。其中，II型株易于引起潜伏感染，是与人类感染最常见相关的类型。弓形虫通过分泌多种效应蛋白来操纵宿主细胞进程，使其能够逃避免疫识别并在宿主细胞内持续复制。在感染过程中，弓形虫会激活宿主细胞中的多种病原相关分子模式（PAMP），这些PAMP被Toll样受体（TLR）、NOD样受体以及胞质DNA传感器如cGAS等模式识别受体（PRR）识别。
cGAS是一种胞质双链DNA（dsDNA）传感器，能够识别外源dsDNA和异常的宿主dsDNA。cGAS催化生成环状GMP-AMP（cGAMP）作为第二信使。cGAMP与位于内质网上的干扰素基因刺激因子（STING）结合，导致STING构象改变并寡聚化。STING激活后，招募TANK结合激酶1（TBK1），后者磷酸化干扰素调节因子3（IRF3）。同时，STING也招募TBK1磷酸化信号转导与转录激活因子6（STAT6），导致STAT6同源二聚化并核转位，启动靶基因转录。磷酸化的IRF3转位至细胞核，启动I型干扰素（IFN）和干扰素刺激基因（ISG，如ISG56）的转录。
作为一种关键的先天免疫介质，cGAS-STING通路在宿主防御弓形虫感染中扮演着关键角色。弓形虫向宿主细胞分泌大量效应分子来调节宿主免疫反应。例如，I型株RH分泌的ROP18激酶能与IRF3相互作用并抑制cGAS-STING-TBK1通路，从而阻止I型IFN的产生。相反，ME49株分泌的效应蛋白GRA15则通过与TRAF蛋白相互作用增强STING的激活。这些对比策略凸显了弓形虫与cGAS/STING/IRF3轴之间复杂的关系，不同株系根据其独特的效应蛋白选择抑制或增强该通路。
GRA3是一种与纳虫空泡膜相关的跨膜蛋白，被报道在包囊发育或维持中起结构或组织作用，是增强弓形虫毒力的重要分泌蛋白之一。研究表明，GRA3可抑制MHC-I类抗原呈递，从而逃逸CD8+T细胞的识别与清除。其C末端含有一个二赖氨酸“KKXX”内质网（ER）检索基序，表明它可能参与调节宿主内质网功能。STING是位于内质网的关键信号分子，暗示GRA3可能通过与STING相互作用来调控宿主免疫反应。
GRA3在低毒力ME49株系中高表达
为了探究GRA3在弓形虫不同株系中的表达差异，研究团队比较了高毒力RH株与低毒力ME49株中GRA3的表达水平。通过RT-qPCR和蛋白质印迹（Western Blot）分析发现，GRA3在低毒力的ME49株中表达显著升高。为了研究GRA3在该株系中的生物学功能，研究人员利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除了ME49株中的GRA3基因。PCR分析和蛋白质印迹结果证实，成功构建了GRA3基因敲除的ME49Δgra3菌株，这为后续研究GRA3在宿主-病原体相互作用、毒力调控和细胞内信号级联调节中的作用奠定了基础。
弓形虫GRA3增强I型干扰素（IFN-β）的产生
既往研究表明，弓形虫感染可通过将效应蛋白分泌到宿主细胞中来激活cGAS-STING-IRF3-IFN-β信号轴。为了研究GRA3在IFN-β调控中的具体作用，研究团队使用ME49野生型（ME49wt）和ME49Δgra3菌株感染小鼠巨噬细胞系RAW264.7、小鼠骨髓源性巨噬细胞（BMDM）和腹腔渗出巨噬细胞（PEM）。感染后24小时的定量分析显示，在所有受测的巨噬细胞亚群中，ME49Δgra3感染的细胞其Ifnb转录水平均显著降低。对细胞培养上清液的ELISA定量分析进一步证实了这一发现，显示感染ME49Δgra3导致RAW264.7细胞中分泌的IFN-β蛋白水平显著下降，在BMDM和PEM细胞中也略有降低。为确定体内相关性，研究人员向C57BL/6小鼠腹腔内接种等量的两种速殖子。感染72小时后收集的脾脏组织和血清样本分析显示，与野生型对照组相比，Δgra3感染小鼠的脾脏中Ifnb转录水平更低，血清中循环IFN-β水平也降低。这些数据共同表明，GRA3是弓形虫感染期间宿主IFN-β反应的关键寄生虫决定因素。
GRA3与STING相互作用以激活STING-TBK1-IRF3信号通路
cGAS-STING信号轴是病原体感染期间I型干扰素产生的主要调节通路。为了阐明GRA3在该通路中的调控作用，研究团队在RAW264.7巨噬细胞中过表达了GRA3-GFP融合蛋白。蛋白质印迹分析显示，GRA3过表达显著增强了STING的磷酸化，并伴随着其下游效应分子TBK1和IRF3磷酸化的增加。免疫荧光分析进一步证明，在过表达GRA3的细胞中，STING寡聚体形成增加，并且p-IRF3的核转位增强。这些发现确立了GRA3作为STING信号级联通路的有效激活剂。
为了探究GRA3与STING之间的相互作用，研究人员在HEK293T细胞中过表达了GRA3-FLAG，并使用抗FLAG抗体进行免疫共沉淀（Co-IP）。随后使用抗STING抗体探测细胞裂解物，结果显示GRA3特异性地与STING发生共沉淀。为了确定弓形虫GRA3与STING在感染细胞中的相互作用，研究人员用ME49wt和ME49Δgra3菌株感染RAW264.7细胞。使用多克隆抗STING抗体对细胞裂解物中的STING进行免疫沉淀，蛋白质印迹显示，在ME49wt感染的巨噬细胞的STING免疫沉淀物中，可以清晰地检测到GRA3。
随后，研究人员在RAW264.7细胞中过表达GRA3-Flag，并使用抗STING抗体进行免疫共沉淀，然后用抗磷酸化-TBK1和抗磷酸化-IRF3抗体分析细胞裂解物。结果表明，STING特异性地与GRA3共沉淀，并且它们的相互作用增强了下游TBK1和IRF3的磷酸化。因此，弓形虫GRA3通过与STING相互作用来激活STING-TBK1-IRF3信号通路。
ME49Δgra3菌株减弱STING-TBK1-IRF3通路激活
研究人员用ME49菌株感染RAW264.7细胞，并在感染后2、6、12和24小时收集蛋白裂解物，以分析STING-TBK1-IRF3通路的激活情况。结果显示，在感染24小时后，STING、TBK1和IRF3的磷酸化水平显著升高。为了探究内源性GRA3在弓形虫感染过程中的作用，研究人员用ME49wt和ME49Δgra3菌株感染巨噬细胞24小时。蛋白质印迹分析表明，与ME49wt感染对照相比，ME49Δgra3感染的细胞中STING磷酸化显著减少。这种减弱延伸到下游信号组分，TBK1和IRF3的磷酸化水平在ME49Δgra3感染的巨噬细胞中也分别降低。免疫荧光测定进一步支持了这些发现，显示ME49Δgra3感染的巨噬细胞中STING寡聚化显著减少，磷酸化IRF3的核转位也减弱。
为了确认GRA3是否通过STING激活TBK1和IRF3，研究人员用STING抑制剂H-151预处理巨噬细胞以抑制STING活性。结果显示，H-151消除了GRA3介导的TBK1和IRF3磷酸化，确立了STING作为GRA3免疫刺激效应的关键上游介质。综上所述，这些结果表明GRA3通过与STING相互作用促进了cGAS-STING信号通路的激活，从而促进了下游信号分子TBK1和IRF3的磷酸化。
GRA3激活STING-STAT6信号通路，且ME49Δgra3菌株降低STAT6磷酸化
既往研究表明，ROP16通过磷酸化STAT6来促进III型弓形虫的生长和存活，而STING已被证明参与STAT6的激活。我们的研究结果表明GRA3与STING相互作用并激活其下游信号。为了探究GRA3是否以类似的方式、依赖STING地调节STAT6磷酸化，研究人员用ME49wt和ME49Δgra3菌株感染巨噬细胞24小时。蛋白质印迹分析显示，与ME49wt感染对照相比，ME49Δgra3感染的细胞中STAT6磷酸化显著降低。为确定这种调节是否需要功能性STING，研究人员用STING抑制剂H-151预处理巨噬细胞。值得注意的是，H-151预处理消除了GRA3介导的STAT6磷酸化和弓形虫profilin表达的增强。此外，用STAT6磷酸化抑制剂AS1517499处理，也抑制了GRA3诱导的STAT6激活和弓形虫profilin的表达。细胞内存活和复制测定表明，AS1517499减弱了GRA3介导的寄生虫增殖增强作用。综上所述，GRA3介导的STING激活促进了STAT6磷酸化，从而增强了弓形虫的增殖。
GRA3促进低毒力寄生虫的增殖
为了确定GRA3在弓形虫增殖中的功能作用，研究人员比较了ME49wt和ME49Δgra3菌株的细胞内复制效率。在HFF单层细胞上进行的斑块形成实验显示，感染10天后，Δgra3寄生虫形成的斑块更少且尺寸更小。这一增殖缺陷通过吉姆萨染色得到进一步证实，结果显示与ME49Δgra3感染的细胞相比，ME49wt感染的细胞中含有四个或更多速殖子的纳虫空泡比例更高。与这些发现一致，蛋白质印迹分析显示，与ME49wt感染对照相比，ME49Δgra3感染的细胞中profilin表达显著降低。
为评估体内毒力，研究人员给C57BL/6小鼠腹腔内感染两种菌株，存活分析显示，与ME49wt感染对照组相比，感染ME49Δgra3菌株的小鼠生存期显著延长。所有这些数据证实，GRA3在体外和体内都能促进ME49寄生虫的增殖。
GRA3通过ISG56介导的机制而非IFN-β增强低毒力寄生虫的增殖
虽然IFN-β通常与抵抗细胞内病原体的防御有关，但新的证据表明，它可能促进特定病原体如单核细胞增生李斯特菌和结核分枝杆菌的持续存在和播散。为了进一步评估IFN-β对弓形虫增殖的影响，研究人员用不同浓度的IFN-β预处理巨噬细胞，并使用蛋白质印迹法评估弓形虫的复制情况。结果显示，与未处理的对照组相比，用IFN-β预处理的细胞中速殖子增殖显著减少。这表明GRA3激活STING-TBK1-IRF3来促进细胞内寄生虫增殖，是通过其他机制而非IFN-β。
先前的研究发现，作为cGAS-STING-TBK1-IRF3信号通路的关键组分，IRF3能促进弓形虫增殖。因此，我们推测弓形虫GRA3诱导的寄生虫增殖可能是通过cGAS-STING-TBK1-IRF3通路中的ISG56介导的。正如预期，过表达pEGFP-C2-GRA3质粒显著增强了ISG56的表达。与此一致的是，我们观察到在ME49Δgra3感染的细胞中，ISG56的表达与ME49wt感染对照相比显著降低。
接下来，研究人员使用了STING特异性抑制剂H-151，发现STING抑制降低了GRA3诱导的ISG56表达，同时伴随着弓形虫profilin表达的减少。为了进一步验证ISG56在弓形虫增殖中的作用，研究人员使用siRNA敲低其表达。蛋白质印迹分析证实了ISG56 siRNA的敲低效率。值得注意的是，沉默ISG56抑制了寄生虫profilin蛋白的表达。细胞内复制实验表明，沉默ISG56减弱了GRA3介导的寄生虫增殖增强作用。综上所述，所有这些结果证明GRA3通过与STING相互作用激活cGAS-STING通路，从而促进IRF3介导的ISG56表达，并促进弓形虫的细胞内增殖。
讨论
I型和II型干扰素在增强宿主防御机制以控制微生物病原体方面至关重要。其中，I型干扰素（IFN-I）多样性最大，包括IFN-β和IFN-α亚型等超过20个家族成员。几乎所有细胞都能在病原体挑战时产生IFN-I。II型干扰素（IFN-II）主要由IFN-γ组成，主要由活化的T细胞和自然杀伤（NK）细胞产生。虽然IFN-γ长期以来被认为是抵抗弓形虫感染的关键免疫效应因子，但最近的研究也揭示，IFN-β在控制弓形虫感染中发挥着关键作用，突显了寄生虫感染期间干扰素反应的复杂性。
弓形虫作为一种广泛流行的细胞内寄生虫，已经进化出复杂的机制来操纵宿主免疫反应，使其能够在宿主细胞内生存和复制，最终建立慢性潜伏感染。cGAS-STING通路在宿主针对细胞内病原体的先天免疫防御中起着关键作用。cGAS作为胞质双链DNA（dsDNA）的传感器，触发STING激活，进而导致I型干扰素（IFN-I）和其他免疫调节因子的产生。
研究表明弓形虫感染可激活cGAS-STING信号通路，导致IFN-I产生。除了cGAS信号传导外，研究还表明弓形虫通过分泌基因型特异性效应蛋白来调节IFN-I通路，使寄生虫能够增强或逃避先天免疫反应。例如，棒状体蛋白ROP18Ⅰ直接结合IRF3，阻止其核转位，从而减少IFN-β表达。相反，致密颗粒蛋白GRA15II以TRAF依赖的方式促进STING多聚泛素化和寡聚化，从而增强宿主cGAS/STING通路并抵抗弓形虫感染。与此同时，ROP16II通过阻断STING的K63连接泛素化来抑制cGAS信号传导，导致IFN-I信号减少。这些不同的效应蛋白采用不同的策略来操纵宿主cGAS/STING通路，逃避免疫监视，从而促进弓形虫的生存。
本研究发现GRA3在低毒力ME49株系中高表达，突显了其在该株系免疫调节中的潜在作用。研究结果表明，ME49Δgra3菌株导致多种巨噬细胞中IFN-β的表达和分泌显著减少，这表明GRA3可能参与调节cGAS/STING信号通路。作为弓形虫分泌的致密颗粒蛋白，GRA3与内质网（ER）功能相关。鉴于关键免疫调节蛋白STING定位于内质网，GRA3很可能通过与STING相互作用来调节宿主免疫反应。免疫共沉淀结果表明，GRA3与STING相互作用，增强了其磷酸化以及下游信号分子TBK1和IRF3的活性。免疫荧光结果表明，GRA3促进了STING寡聚化，并促进了p-IRF3从细胞质到细胞核的转位。增殖实验表明，GRA3缺陷株的复制能力显著受损，这表明弓形虫GRA3能促进寄生虫增殖。
然而，GRA3增强了cGAS-STING信号通路的激活以及随后的IFN-β上调，而IFN-β似乎会抑制弓形虫增殖。因此，对这一看似矛盾现象的一个可能解释是，GRA3激活cGAS/STING通路也可能诱导某些促进寄生虫增殖的宿主基因表达，但不一定通过IFN-β。STING激活导致STAT6的招募。随后，STING也招募TBK1，TBK1磷酸化STAT6并触发其同源二聚化和核转位。STAT6二聚体随后结合靶位点以启动转录。既往研究表明，ROP16介导的STAT6激活抑制活性氧（ROS）的产生，从而促进III型弓形虫的生长和存活。此外，ROP16促进替代性（M2）巨噬细胞极化并上调精氨酸酶-1，从而减少一氧化氮（NO）的产生，并将宿主免疫环境转向抗炎状态。总的来说，这些变化创造了一个更有利的细胞内环境，进一步支持寄生虫的复制和存活。在本研究中，我们观察到GRA3上调宿主细胞中STAT6的磷酸化。相反，抑制STING会下调p-STAT6水平并抑制寄生虫增殖。
I型干扰素（IFN-I）通过自分泌或旁分泌信号诱导约300个干扰素刺激基因（ISG）的转录，从而增强宿主细胞抵抗病原体的能力。尽管IFN-I在抗病毒防御中起着关键作用，但其产生必须受到严格调控，以防止过度和有害的免疫反应。有趣的是，在评估超过350个人类ISG的抗病毒活性时，发现25个基因能够增强某些病毒的感染性。其中许多基因的表达强烈依赖于TBK1/IRF3信号通路。其中，ISG56被报道参与IFN-I产生和抗病毒反应的负反馈调节。最近的研究发现，ISG56不仅可以在病毒感染期间被激活，也可以在寄生虫感染期间被激活。cGAS-STING信号通路在弓形虫感染期间表现出双刃剑作用。一方面，它诱导I型干扰素（如IFN-α和IFN-β）的产生，从而激活宿主的先天免疫反应以限制寄生虫入侵。另一方面，研究表明IRF3能够独立于IFNAR信号传导，抑制巨噬细胞中IFN-γ介导的细胞内病原体限制，这表明正常的IRF3活性可能会削弱宿主IFN-γ依赖性防御，并间接为病原体生存提供有利环境。此外，Majumdar及其同事证明，STING-IRF3-IDO1信号通路可促进弓形虫复制。因此，ISG56不会伤害寄生虫，相反，它似乎更有效地促进了弓形虫的增殖。在我们的研究中，我们观察到GRA3上调宿主细胞中ISG56的表达。抑制STING不仅下调了ISG56表达，还显著抑制了弓形虫增殖。此外，敲低ISG56也显著减少了寄生虫复制，这表明GRA3可以通过激活ISG56来促进弓形虫在宿主细胞中的增殖。
结论
总之，我们的研究结果表明，在感染过程中，GRA3驱动的cGAS-STING通路激活诱导了ISG56、p-STAT6和IFN-β的产生，从而在宿主防御和免疫耐受之间建立了一种调节平衡。这种由STING-TBK1依赖性表达ISG56和p-STAT6介导的平衡，可能抑制了过度的I型干扰素反应，从而维持了一个更有利于其生存和复制的细胞内环境。这样，ISG56和STAT6充当了一个分子开关，防止宿主免疫反应过度激活，同时不经意间促进了弓形虫的增殖。这就在免疫激活和免疫逃逸之间建立了动态平衡，促进了寄生虫的适度复制，并使低毒力弓形虫株系能够在宿主体内实现长期潜伏感染。
总而言之，这些研究表明，弓形虫GRA3能够与STING相互作用，激活TBK1和IRF3。这种相互作用促进了IRF3介导的ISG56转录以及STAT6磷酸化，最终促进了弓形虫的增殖。这种调节机制使寄生虫能够在不被宿主免疫系统完全抑制的情况下建立慢性感染。这些发现不仅突显了GRA3作为免疫调节效应分子的关键作用，也为破坏寄生虫操纵宿主防御提供了潜在的治疗靶点。
