《PLOS Pathogens》：Targeting surface cell antigen 2 increases sensitivity of Rickettsia typhi detection
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本研究针对鼠型斑疹伤寒（Murine typhus）诊断困难的问题，开发了一种新型qPCR检测方法。该方法靶向鼠型斑疹伤寒病原体（R. typhi）基因组中含有多重重复序列的表面细胞抗原2（sca2）基因，相比目前广泛使用的单拷贝基因靶点（ompB），新方法显著提升了检测灵敏度，为临床早期诊断提供了更有效的手段。本刊特此推荐，以飨读者。
引言
鼠型斑疹伤寒（Murine typhus）是一种由鼠型斑疹伤寒立克次体（Rickettsia typhi）引起、经蚤传播的疾病，呈全球性分布，在老挝人民民主共和国（Laos）等地均有流行。该病通常表现为急性发热性疾病，但其症状与其他感染性疾病相似，导致临床诊断经常被遗漏，从而延误了适当的抗生素治疗。目前，鼠型斑疹伤寒缺乏单一的诊断金标准，血清学与急性期样本的聚合酶链式反应（PCR）联合使用是广泛接受的诊断方法。然而，一些血清学方法无法为早期临床决策提供快速结果。相比之下，靶向R. typhi特异性基因的定量PCR（qPCR）因其可在急性期患者样本中检测到细菌DNA，成为早期诊断的宝贵工具。
目前用于检测R. typhi的qPCR通常以单拷贝的外膜蛋白B（ompB）基因为靶点，但其灵敏度有限，特别是在细菌载量较低的患者中。受到针对另一种专性细胞内细菌恙虫病东方体（Orientia tsutsugamushi）的重复基因序列可提高诊断灵敏度的启发，本研究旨在应用类似策略来改进鼠型斑疹伤寒的诊断。表面细胞抗原（Sca）蛋白属于立克次体中的自转运蛋白家族。R. typhi基因组编码五种Sca蛋白，其中sca2基因在一个150碱基对的区域内包含六个串联重复序列。鉴于其对R. typhi胞内复制的重要作用，sca2基因代表了诊断检测的一个有前景的新靶点。本研究旨在通过靶向包含重复序列的基因区域（sca2）来开发一种用于R. typhi检测的qPCR方法，并与现有的靶向ompB的qPCR检测方法进行性能比较。
方法
检测方法的开发
研究人员首先在R. typhi Wilmington菌株的sca2基因全长序列中鉴定出四个含有重复序列的区域。其中位于2360–3262位置的区域重复拷贝数最多（6个），序列长度最大，因此被选为qPCR检测方法开发的靶点。针对此区域设计了特异性引物，其序列为：sca2F 5’- TGGAATGGACAGTAAAACGACAG-3’ 和 sca2R 5’- CGTTCTGCTGCCTCTTCTGA-3’。为确保特异性，研究人员对设计的引物进行了生物信息学分析和实验验证。通过PCR检测多种R. typhi菌株（Wilmington, AZ331和GER）以及其他细菌（如普氏立克次体、猫立克次体、康氏立克次体、恙虫病东方体等）的DNA，证实sca2检测方法仅特异性扩增R. typhi菌株的DNA。
为定量检测R. typhi，研究建立了靶向sca2和ompB的qPCR方法。sca2 qPCR的Taqman探针序列为：sca2P: 5’-FAM- ACAGATAACATAGCAGCAGAATCT-BHQ1-3’。为了提高扩增效率，在sca2 qPCR反应体系中加入了牛血清白蛋白（BSA）以稳定DNA聚合酶并减轻重复序列中常出现的二级结构的抑制作用。通过使用含有已知浓度（106至 100拷贝/微升）的R. typhi sca2或ompB片段的质粒标准品绘制标准曲线，以计算样本中的细菌DNA拷贝数。
检出限与诊断准确性测试
为确定两种qPCR方法的检出限，研究使用了连续10倍稀释的质粒标准品以及用R. typhi菌体掺入健康献血者全血制备的模拟样本。通过蚀斑实验确定掺入血液的立克次体量（蚀斑形成单位，PFU），然后提取DNA并用两种qPCR方法进行定量。
临床验证使用了储存的EDTA抗凝血沉棕黄层（buffy coat）样本，共88例来自老挝马霍索医院或省医院的发热患者。这些样本被分为三组：第一组样本通过细胞培养、间接免疫荧光法（IFA）和ompB PCR确认感染状态；第二组样本通过配对血清的IFA确认；第三组样本则通过快速诊断试验（RDT）结果被归类为对鼠型斑疹伤寒和恙虫病阴性。通过比较sca2和ompB qPCR在这些样本中的检测结果，计算了两种方法的灵敏度、特异性，并比较了检测到的细菌基因拷贝数。
结果
sca2基因的重复序列特征
分析证实，R. typhi的sca2基因全长存在四个含有重复序列的区域，其中位于2360–3262位置的区域具有最高的重复拷贝数（6个拷贝），因此被选为检测靶点。
检测方法的特异性
生物信息学分析和实验PCR结果均表明，设计的sca2引物对R. typhi具有高度特异性，可扩增不同R. typhi菌株，但不与其他立克次体种或其他测试细菌发生交叉反应。
qPCR方法的优化与检出限比较
使用质粒标准品的实验表明，ompB qPCR的检出限为10拷贝/微升，而sca2 qPCR的灵敏度更高，检出限可达1拷贝/微升。在用R. typhi掺入全血的实验中，ompB qPCR能够检测到3 PFU/300微升全血中的细菌，而sca2 qPCR的灵敏度更高，可检测到0.3 PFU/300微升全血中的细菌。
灵敏度与特异性测试
在临床样本测试中，sca2 qPCR检测R. typhi的灵敏度为59.09%（95% CI， 38.73-76.74%），特异性为100%（95% CI， 93.98-100%）。相比之下，ompB qPCR的灵敏度为36.36%（95% CI， 19.73-57.05%），特异性同样为100%（95% CI， 93.98-100%）。
细菌基因拷贝数定量比较
对qPCR阳性样本的细菌基因拷贝数进行定量分析发现，使用sca2基因检测到的中位拷贝数为16，500 拷贝/微升（IQR， 13，045–40，000），而使用ompB基因检测到的中位拷贝数仅为19.25 拷贝/微升（IQR， 11.11-56.62），两者相差约2.933个对数单位（约800倍），具有极显著的统计学差异（P < 0.0001）。
讨论
本研究成功开发了一种靶向含有六个重复序列的sca2基因的qPCR检测方法，用于检测R. typhi。与单拷贝的ompB基因不同，该方法利用了每个基因组中存在的多个模板拷贝，从而提高了对鼠型斑疹伤寒患者常见的低水平菌血症（约200拷贝/微升）的分析灵敏度。这种多重拷贝基因策略已成功用于检测无症状感染中的恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）和间日疟原虫（Plasmodium vivax）等病原体。本研究的体外实验表明，基于sca2的检测方法可比基于ompB的检测方法多检测出10倍低浓度的DNA（1拷贝/微升对10拷贝/微升）。在掺菌样本中，sca2检测法的检出限（0.3 PFU）也低于ompB检测法（3 PFU）。
对细菌基因拷贝数的定量显示，sca2检测法测得的数值显著高于ompB检测法，尽管根据重复拷贝数理论预期仅提高6倍，但实际观察到约800倍的差异。这可能由多种因素造成：首先，TaqMan探针在每个PCR循环中可裂解新的探针，从而更快地产生荧光信号；其次，重复序列内的二级结构可能使扩增子更易接近，从而增强了引物和探针的结合；第三，由于热力学优势，重复序列可能比单拷贝靶点扩增效率更高；最后，在串联重复基因中，引物和探针可能在延伸过程中多次重新结合，进一步增加了荧光信号。
尽管sca2检测法比ompB更敏感，并且可以在细菌载量低的临床样本中检测到更低的拷贝数，但成本预计不会更高，因为该检测法仅引物序列不同，且使用相同的探针标记化学物质。只有当需要更长的寡核苷酸时，成本才会增加。
sca2 qPCR检测法在测试人群中具有可行性，可与ompB检测法联合使用。由于鼠型斑疹伤寒患者通常细菌载量较低，基于ompB的qPCR可能无法检测到低水平的DNA。在这种情况下，sca2 qPCR可作为补充靶点，提高诊断的置信度。抗生素治疗会降低细菌载量，并同样影响所有靶点的检测。因此，sca2检测灵敏度的提高反映了其在低细菌载量下分析灵敏度的增强，而非基因特异性效应。
本研究也存在一些局限性。特异性测试有限，因为并非所有立克次体种的DNA都可用。用于验证检测方法的临床样本数量较少。开发的检测方法仅针对血沉棕黄层样本进行了优化，未针对其他样本类型（如媒介和宿主动物）进行测试。此外，仅评估了两种检测方法，未将其他含有重复序列的基因（如编码锚蛋白重复蛋白、patatin样磷脂酶的基因）与sca2进行比较。最后，由sca2和ompB确定的立克次体靶基因拷贝数仅从qPCR阳性样本中计算得出，因此并不代表所有通过金标准方法（IFA）检测为阳性的患者。
结论
本研究优化了一种靶向含有重复序列的sca2基因的qPCR方法，用于诊断人类R. typhi感染。该检测方法对R. typhi具有特异性，不与其他立克次体物种或一组其他细菌发生交叉反应。使用质粒标准品和掺入人血的细菌进行的体外研究表明，sca2检测法的检出限比目前常用的R. typhi检测靶点ompB低约10倍。使用患者储存的血沉棕黄层样本进行的灵敏度和特异性测试支持了这一发现。此外，使用sca2进行细菌定量所得出的数值比使用ompB检测法高出约2.9个对数。总体而言，靶向sca2的qPCR检测法是诊断通常具有低细菌载量的R. typhi患者的一个有前景的工具。
未来的工作将集中于优化sca2检测法以适应不同的样本类型（包括媒介和宿主动物），以支持监测研究，并使用更大的临床样本集验证该检测方法。研究人员还将研究其他含有重复序列的靶基因，并将其性能与sca2和ompB进行比较。最终，研究团队旨在利用选定的靶点开发基于CRISPR-Cas的侧向流动诊断检测法，并用前瞻性患者样本进行验证。
