用于体内过氧亚硝酸盐双光子近红外成像的D–π–A–π–D骨架的分子工程

《Dyes and Pigments》：Molecular Engineering of a D–π–A–π–D Scaffold for Two-Photon Near-Infrared Imaging of Peroxynitrite In Vivo

精准可视化生物体内过氧化亚硝酸盐（ONOO?）仍面临挑战。本文设计了一种基于D-π-A-π-D结构的近红外荧光探针XH-ONOO，结合 coumarin 和 BF?-bdk 核心优势，实现快速响应（<20秒）、低检测限（22nM）及高特异性识别ONOO?。其通过双光子激发（740nm）可实现深组织高对比成像，已在活细胞和小鼠模型中成功追踪ONOO?动态分布，为氧化应激研究提供新工具。

　　

王晓辉|孙海娇|王振焕|栾俊宇|辛硕|王坤鹏|方颖|胡志强

中国山东省青岛市青岛科技大学化学与分子工程学院，教育部先进光学聚合物与制造技术国家重点实验室，生命科学光电传感与分析化学重点实验室，266042

摘要

由于过氧亚硝酸盐（ONOO^?）的瞬态性质以及需要深入组织的光学穿透，其在生物系统中的精确可视化仍然具有挑战性。在这里，我们报道了一种名为XH-ONOO的近红外荧光探针，该探针采用供体–π–受体–π–供体（D–π–A–π–D）骨架设计，通过将富电子的香豆素单元与β-二酮酸酯-BF₂受体结合而成。量子化学分析阐明了其优化的共轭结构和电荷转移特性。XH-ONOO对ONOO^?表现出超快且高度选择性的响应，产生超过250纳米的发射波长位移，从而最小化了探针与其反应产物之间的光谱串扰。值得注意的是，该探针支持高效的双光子激发（740纳米），能够实现活细胞中外源性和内源性ONOO^?的高对比度成像。此外，XH-ONOO在小鼠模型中实现了组织的高分辨率ONOO^?成像，证明了其作为追踪复杂生物环境中氧化炎症信号的敏感且多功能工具的实用性。

引言

过氧亚硝酸盐（ONOO^?）是一种高活性的氧物种（ROS）和氮物种（RNS），在体内通过一氧化氮（•NO）和超氧阴离子（O₂•^?）之间的快速扩散控制反应生成1, 2, 3。由于其强大的氧化和亲核能力，ONOO^?在生物系统中扮演着双重角色。在生理水平上，它参与关键的信号通路和免疫反应4, 5, 6, 7。然而，其过量产生与氧化应激和硝化损伤密切相关8, 9。它可以修饰蛋白质、脂质和核酸，从而破坏细胞稳态，并导致多种疾病的发生，包括慢性炎症、神经退行性疾病、心血管疾病和癌症10, 11, 12。由于其极短的半衰期、高反应性和低内源性浓度，实时追踪ONOO^?仍然是一个重要的分析挑战12, 13, 14, 15。因此，开发可靠的ONOO^?检测和成像方法对于阐明其生物学作用和探索相关疾病机制至关重要。

荧光探针因其卓越的特性而成为生物检测不可或缺的工具，包括高灵敏度、非侵入性、出色的时间和空间分辨率以及能够在活体系统中进行实时监测16, 17, 18, 19。特别是具有近红外（NIR）发射的双光子荧光探针，具有更深的组织穿透深度、更低的光损伤和最小的背景自荧光，非常适合用于可视化活体系统中的生物活性分子20, 21, 22, 23, 24。双光子荧光显微镜（TPFM）也因其显著的生物成像应用优势而受到广泛关注25, 26, 27, 28, 29。通过使用NIR光进行激发，TPFM比传统的单光子方法能够实现更深的组织穿透。这种方法减少了光散射，降低了自荧光背景，并大幅降低了光毒性和光漂白效应，允许对活体系统进行长时间的观察，同时提高了空间分辨率30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37。

基于二氟硼β-二酮酸酯（BF₂bdk）核心结构的荧光染料具有多种优势特性，如易于修饰、较大的斯托克斯位移、高量子产率和优异的光稳定性38, 39, 40, 41, 42, 43。这些特性使它们在生物成像、环境监测和智能材料开发中得到广泛应用。此外，BF₂bdk结构本质上是模块化的，通过简单合成修饰β-二酮酸酯配体可以轻松调节，从而精确调整吸收/发射谱型并引入特定的识别单元44, 45, 46, 47, 48

在这里，我们报道了一种新型双光子荧光探针XH-ONOO的战略设计和合成，用于检测ONOO^?。该探针基于扩展的香豆素-BF₂bdk共轭平台（方案1a），结合了香豆素（例如良好的生物相容性、易于修饰和刚性平面结构）和BF₂bdk复合物（例如高荧光量子产率、大的斯托克斯位移和优异的光稳定性）的优点。在这种分子结构中，BF₂bdk平台作为中心的电子受体（A）单元。在该核心的两侧引入了4-二乙氨基取代的香豆素部分，选择它是因为其强的电子供体（D）能力和有助于共轭延伸的刚性平面结构。这种配置建立了一个坚固的D–π–A–π–D分子框架。此外，结构中还引入了一个作为ONOO^?识别位点的反应性双键。这一设计显著扩展了共轭平面并促进了强烈的分子内电荷转移（ICT），导致发射波长向NIR区域显著红移，并大大增强了双光子吸收截面（σ2）。XH-ONOO表现出显著的光物理特性，发射峰位于755纳米。它与ONOO^-的反应会断裂双键，中断共轭系统并导致超过250纳米的显著蓝移。这种大的光谱差异最小化了探针与其产物之间的信号干扰。该探针还对其他反应物种具有高选择性、快速响应时间（< 20秒）和低检测限（22 nM）。此外，它已成功应用于活细胞中外源性和内源性ONOO^?的双光子成像，并在小鼠模型中可视化ONOO^?，证实了其作为研究ONOO^-相关生理和病理过程的可靠工具的潜力。

实验部分

除非另有说明，所有材料均从商业供应商处购买并按原样使用。对于光谱测量，准备了1.0 mM的XH-ONOO在二甲基亚砜（DMSO）中的 stock solution。所有实验的测量介质为磷酸盐缓冲盐水（PBS；0.01 M，pH 7.4），含有75%（v/v）DMSO。有关材料、仪器和方法的更多详细信息，请参见支持信息。

XH-ONOO的设计与合成

与传统的线性D-π-A骨架分子相比，D-π-A-π-D结构分子包含两个供体部分，实现了双分子内电荷转移（ICT）相互作用，显著提高了ICT效率49, 50。在这种配置中，电子受体和供体分别位于分子的中心和末端。增强电子吸引能力是一种有效的策略，可以红移吸收和发射波长

结论

总之，我们成功开发了一种新型近红外荧光探针XH-ONOO，基于香豆素–BF₂bdk混合平台，能够特异性识别和检测ONOO^-。XH-ONOO的D-π-A-π-D结构表现出出色的电荷转移特性，这一点通过量子化学分析得到了证实。XH-ONOO对ONOO^-的优异响应体现在其快速响应（< 15秒）和低检测限（22 nM）上。

CRediT作者贡献声明

栾俊宇：验证、研究、数据分析。王振焕：软件开发、研究、数据分析。孙海娇：验证、研究、数据分析、数据管理。王晓辉：初稿撰写、可视化、研究、数据分析、概念构思。方颖：撰写与编辑、监督、项目管理、资金争取、概念构思。王坤鹏：撰写与编辑、监督、软件开发、项目

利益冲突声明

作者声明他们与本研究无任何利益冲突。

致谢

本工作得到了国家自然科学基金（22377064）和山东省自然科学基金（ZR2025QC136）的支持，以及山东省高等学校青年科技创新支持计划（2024KJG054）的资助。