《European Journal of Medicinal Chemistry》：Design and Optimization of Potent, Selective, and Peripherally Acting JNK3 Inhibitors for Chronic Kidney Disease
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本研究设计并合成了新型2-芳基-3-吡啶-4-基-1H-吲哚衍生物，作为高选择性的JNK3抑制剂用于慢性肾病治疗。通过模块化合成策略优化结构-活性关系，发现化合物50b和50d具有纳米摩尔级抑制活性，有效降低纤维化标志物并保护肾小球足细胞。其药代动力学特性表明低血脑屏障穿透性，为开发安全有效的肾纤维化治疗药物提供了候选化合物。
林哲熙（Cheol Hee Lim）|崔秀妍（Suyeon Choi）|朴海彬（Haebeen Park）|Swapnil P. Bhuzbal|朴奎尚（Kyusang Park）|哈贞美（Jung-Mi Hah）
韩国京畿道安山市桑诺克区汉阳大学路55号汉阳大学药学院，邮编15588
摘要
慢性肾病（CKD）的特征是进行性纤维化和足细胞损伤，部分由TGF-β依赖的MAPK信号通路驱动。尽管全JNK抑制剂显示出抗纤维化效果，但其异构体选择性和安全性仍是一个主要挑战。本文报道了一类新的2-芳基-3-嘧啶-4-基-1H-吲哚衍生物的设计、合成和生物学评估，这些衍生物作为强效且具有外周作用机制的JNK3抑制剂用于治疗CKD。模块化的合成策略使得吲哚核心和嘧啶取代基能够系统性地多样化，从而可以进行详细的结构-活性关系研究。通过对羟基取代基和芳基的选择性优化，获得了多种低纳摩尔浓度的JNK3抑制剂。其中，50b（IC50 = 2.08 nM）和50d（IC50 = 1.44 nM）被证明是最有效的化合物。诱导契合对接显示这两种化合物都能与Met149结合，并且具有增强的疏水作用和硫-π相互作用。针对50种激酶的广泛激酶组分析表明，它们的活性谱主要局限于JNK1、JNK2和p38α，且具有显著的选择性。在TGF-β1刺激的人类足细胞中，这些化合物有效抑制了c-Jun的磷酸化，且无细胞毒性。值得注意的是，50b显著降低了促纤维化标志物（COL1A1和PAI-1）的水平，并显著恢复了E-钙粘蛋白的表达，表明其对足细胞损伤具有保护作用。50b和50d在血浆中表现出良好的稳定性，在微粒体中也有中等稳定性，并且在BBB-PAMPA实验中显示出低通透性，这与SwissADME预测一致。总体而言，本研究将50b和50d确定为有前景的候选化合物，并证明了2-芳基-3-嘧啶-4-基-1H-吲哚骨架作为开发选择性、非中枢神经系统穿透性JNK3抑制剂的有效化学类型。
引言
慢性肾病（CKD）是一种进行性疾病，其特征是氧化应激、炎症、纤维化和足细胞损伤，最终导致肾功能障碍[1, 2]。经典和非经典信号通路之间的相互作用——特别是涉及丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路——在肾小球硬化和足细胞损伤的发展中起着关键作用[3]。与ERK1/2类似，JNK和p38位于MAPK通路的第三层，由MAP激酶激酶（MKKs）激活。转化生长因子-β（TGF-β）信号通过MKK4/7激活JNK，通过MKK3/6激活p38，通常由TGF-β激活的激酶1（TAK1）介导[4, 5]。
JNK（c-Jun N末端激酶）家族包括三种异构体——JNK1、JNK2和JNK3，分别由MAPK8、MAPK9和MAPK10编码[6]。这些激酶通过磷酸化c-Jun来调节转录反应，c-Jun与c-Fos二聚形成AP-1转录因子复合物，从而调节与炎症、分化和凋亡相关的基因[7]。在这些异构体中，JNK1和JNK2在多种组织中广泛表达，而JNK3在中枢神经系统、心脏和睾丸中的表达受限[8, 9]。
这种表达限制区分了JNK3与JNK1和JNK2，暗示了它们具有根本不同的功能作用。JNK1和JNK2在多种组织中普遍参与应激反应，而JNK3似乎在病理条件下才选择性地被激活。这种可诱导性和组织特异性行为为将JNK3作为疾病修饰激酶提供有力依据，同时可能避免全JNK抑制带来的全身性副作用。
JNK1已被确定为多个器官（包括肾脏）中促纤维化信号的关键驱动因素。它促进成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化，促进细胞外基质（ECM）的积累，并上调TGF-β1和CTGF等促纤维化介质[10, 11]。因此，包括SP600125和CC-401在内的全JNK抑制剂在实验性肾病模型中显示出抗纤维化效果和减轻肾小管凋亡的作用[12, 13]，突显了JNK通路阻断在CKD中的治疗相关性。
尽管全JNK抑制剂有效，但它们同时阻断了对多种器官生理应激适应至关重要的多种JNK异构体，这引发了关于长期安全性和靶点选择性的担忧。这些考虑突显了针对CKD等慢性疾病的异构体选择性JNK抑制策略的潜在优势。
虽然JNK3传统上被认为在阿尔茨海默病和帕金森病等神经退行性疾病中起作用[14, 15, 16]，但最新研究表明它也可能参与肾脏病理。最近的研究表明，在CKD条件下以及肾小球硬化实验模型中，JNK3（MAPK10）的表达上调，其活性与c-Jun的磷酸化及疾病严重程度相关[17]。重要的是，选择性抑制JNK3已被证明可以减轻足细胞损伤，抑制TGF-β介导的肾小球纤维化，并改善肾功能，从而确定JNK3是CKD中的治疗相关靶点[17, 18]。
在我们之前的研究中，基于咪唑-嘧啶核心（[17]）和咪唑[2,1-b]噻唑-嘧啶核心（[18]）的JNK3选择性抑制剂JMH021有效缓解了足细胞功能障碍和肾小球硬化，证明了选择性JNK3抑制可以独立于JNK1阻断预防肾纤维化重塑[17, 18]。这些发现将JNK3的生物学意义扩展到其在中枢神经系统中的作用之外，强调了其在肾脏应激信号传导和不良重塑中的贡献。
为了进一步提高转化潜力，我们正在进行的研究专注于设计无法穿透血脑屏障（BBB）的JNK3抑制剂，以适用于肾纤维化等外周疾病。这一策略旨在保持异构体选择性，同时最小化对中枢神经系统（CNS）的暴露，从而提高治疗安全性和选择性。基于我们第一代苯并咪唑先导化合物（1）[19]的共晶结构，我们设计了一种新的基于吲哚的骨架，以维持JNK3 ATP结合口袋内的两个关键药效团相互作用。首先，吲哚2位上的芳基多样化可以实现硫-π稳定；其次，1位上的N-H基团有助于与Lys93形成水介导的氢键（图1）。基于这些原则，我们提出了一种2-芳基-3-嘧啶-4-基-1H-吲哚骨架作为下一代选择性JNK3抑制剂的化学类型。对接模拟证实该骨架保持了核心相互作用，同时表现出增强的结合亲和力，为开发强效且选择性的JNK3抑制剂提供了有希望的基础。
这种骨架的进化不仅基于效力优化，还考虑了异构体选择性和外周限制的需求，这些是开发慢性抗纤维化疗法的关键因素。
化学
2-芳基-3-嘧啶-4-基-1H-吲哚衍生物的通用合成路线如图1所示。目标化合物通过模块化的多步骤策略合成，该策略允许对吲哚核心和嘧啶取代基进行系统性的变化。
首先，将取代的2-碘苯胺（1–6）与一系列芳香族末端炔烃（a–e）通过Sonogashira偶联反应连接，随后进行5-endo-dig环化，得到相应的
结论
总之，我们开发了一系列新的2-芳基-3-嘧啶-4-基-1H-吲哚衍生物，作为强效的JNK3抑制剂，其设计基于苯并咪唑共晶模板的结构导向原则。系统的结构-活性关系（SAR）研究表明，吲哚核心上的羟基位置和芳基及R3取代基的优化是决定活性的关键因素，从而获得了多种低纳摩尔浓度的抑制剂。其中，50b和50d是最有前景的候选化合物
通用化学
研究中使用的所有化学品均为试剂级，购自Aldrich（美国）、TCI（韩国）或Alfa Aesar、Acros。化合物通过使用硅胶60（200-300目ASTM，E. Merck，德国）的柱层析法进行纯化。用于柱层析的硅胶量是待纯化化合物重量的50-100倍。薄层色谱（TLC）在涂有硅胶的铝板上进行（硅胶60 GF254，E. Merck，德国）
CRediT作者贡献声明
朴海彬（Haebeen Park）： 数据整理。崔秀妍（Suyeon Choi）： 方法学、实验研究。林哲熙（Cheol Hee Lim）： 初稿撰写、实验研究、数据分析、概念化。哈贞美（Jung-Mi Hah）： 文稿审阅与编辑、初稿撰写、验证、监督、实验研究、资金获取、数据整理、概念化。朴奎尚（Kyusang Park）： 实验研究、概念化。Swapnil P. Bhuzbal： 数据可视化、数据整理
注释
作者声明他们是本手稿中描述的JNK3抑制剂的待批专利申请的发明人。
利益冲突声明
? 作者声明他们是对本手稿中描述的JNK3抑制剂待批专利申请的发明人。
致谢
本工作得到了韩国国家研究基金会（National Research Foundation of Korea）的资助，项目编号为RS-2020-NR049583（蛋白质病理学中心）、RS-2024-00397929（J.-M.H.）和RS-2024-00333784（J.-M.H.）
