以Fe?O?@SiO?/Schiff碱/Cu(II)纳米粒子增强的海藻酸盐水凝胶薄膜在促进糖尿病伤口愈合中的应用

《Experimental Cell Research》：Alginate hydrogel film reinforced with Fe 3O 4@SiO 2/Schiff-base/Cu(II) nanoparticles in promoting diabetic wound healing

糖尿病伤口愈合中，Fe3O4@SiO2/Schiff-基Cu(II)纳米颗粒负载的Na-alginate水凝胶通过1% Cu NP浓度显著促进伤口闭合、胶原沉积和新生血管形成，同时抑制炎症反应，而10%浓度效果不佳，揭示浓度依赖性治疗窗口。

　　

塞迪格·阿扎迪（Sedigheh Azadi）、阿里雷扎·阿巴斯普尔（Alireza Abbaspour）、赛义德·雷扎·卡萨伊（Seyed Reza Kasaee）、法哈德·库赫佩伊玛（Farhad Koohpeyma）、埃斯马特·阿齐齐普尔（Esmat Azizipour）、阿里·穆罕默德·阿马尼（Ali Mohammad Amani）、萨雷赫·莫斯莱-希拉齐（Sareh Mosleh-Shirazi）、赫萨姆·卡米亚布（Hesam Kamyab）、D. 沙姆穆加普里亚（D. Shanmugapriya）

伊朗设拉子医科大学高级医学科学与技术学院医学纳米技术系

摘要

为了促进糖尿病伤口的愈合，我们合成了嵌入海藻酸钠水凝胶中的Fe₃O₄@SiO₂/Schiff-碱基复合物与Cu(II)磁性纳米颗粒（MNPs）的复合物。本研究分析了1%和10%浓度的Cu(II)纳米颗粒（NPs）对糖尿病大鼠模型中伤口闭合和组织再生的影响。使用链脲佐菌素诱导的糖尿病Sprague-Dawley大鼠来评估NPs的体内疗效。表征方法包括使用数字摄影进行伤口闭合量化、组织病理学分析以及统计方法进行数据解释。研究结果表明，含有1% Cu纳米颗粒的水凝胶显著改善了伤口愈合，包括促进上皮再生、胶原蛋白沉积、新生血管形成和肉芽组织形成，并减少了炎症。而10% Cu纳米颗粒的配方并未显示出相同的效果，这表明铜离子的释放存在浓度依赖性的治疗窗口。这种新型纳米颗粒水凝胶展示了基于铜的纳米颗粒在糖尿病伤口管理中的潜力，为治疗这一全球性健康问题提供了一种成本效益高且前景广阔的方法。

引言

糖尿病（DM）是最常见的慢性代谢性疾病，其特征是由于胰岛素缺乏（1型）或胰岛素抵抗（2型）导致的高血糖[1]。1型糖尿病是由于自身免疫系统破坏胰腺β细胞引起的，而2型糖尿病则是由于胰岛素抵抗导致胰腺β细胞功能衰竭[2]。其他类型的糖尿病则由胰腺疾病、药物或化学物质、β细胞功能遗传问题、妊娠相关葡萄糖不耐受等因素引起[3]。最新研究表明，全球有超过5亿人患有糖尿病，相当于每十个成年人中就有一个患有此病。2021年，20至79岁成年人中的糖尿病患病率为10.5%（即5.366亿人），预计到2045年这一比例将上升至12.2%[4]。

糖尿病除了长期高血糖外，还会导致多种并发症，如糖尿病溃疡、心肌病（心血管疾病）、神经病变（神经损伤）、肾病（肾脏损伤）、听力损失和痴呆[3] [5]。糖尿病伤口的问题非常严重，对医疗系统和患者造成了巨大的社会和经济影响，尤其是糖尿病足溃疡（DFUs）或难以愈合的糖尿病伤口，这些并发症会导致高昂的医疗费用、残疾和预期寿命缩短[1] [4]。更重要的是，由于微循环异常、细胞功能障碍、氧化应激增加和缺氧，糖尿病伤口可能会引发慢性无法治愈的溃疡，这是导致截肢和残疾的主要原因[2] [6]。

急性伤口和慢性伤口是两种不同的类型。急性伤口通常在创伤或手术后形成，并按止血、增生、炎症和重塑的经典顺序发展[7]。伤口愈合过程需要各种细胞、生长因子和细胞因子的协同作用。伤口愈合的第一阶段是炎症，主要由巨噬细胞引起。巨噬细胞负责清除细菌和失活的宿主细胞，并通过产生多种分子来促进细胞外基质（ECM）的形成、纤维增生和血管生成[8]。血管生成在整个愈合过程的最后阶段持续进行。血管生成的关键步骤是内皮细胞的增殖、迁移和修饰，随后形成血管管腔[8]。在伤口愈合的最后一个阶段，成纤维细胞的增殖有助于重建伤口部位的结构和功能[7]。

然而，糖尿病感染会改变这种愈合模式。由于中性粒细胞在伤口中的长期存在以及巨噬细胞的功能障碍，这些因素导致生长因子减少，同时炎症因子和蛋白酶过度产生，从而加剧了炎症反应，延长了伤口愈合时间，且不再支持上皮再生或肉芽组织形成[9] [10]。此外，当糖尿病伤口感染恶化时，正常功能的细胞可能会发生异常行为，甚至可能导致细胞损伤和凋亡。此外，伤口部位的炎症细胞会产生过量的活性氧（ROS），减缓愈合过程。因此，在糖尿病伤口愈合策略中应处理伤口感染和清除多余的ROS[9]。此外，机会性病原体可以侵入伤口，导致多微生物感染，这些病原体包括铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、大肠杆菌（Escherichia coli）、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumonia）、变形杆菌（Proteus）属细菌以及脆弱拟杆菌（Bacteroides fragilis）等，还包括厌氧细菌[11]。

目前，敷料更换、清创、伤口减压、血管评估、血糖控制和感染控制是管理糖尿病伤口的标准方法，但这些方法效果有限[1] [11] [12]。最近，科学和技术的进步催生了多种新型伤口敷料的发展，包括多孔薄膜、水凝胶、水胶体、三维（3D）打印支架、纺织品和纳米纤维敷料[13]。这些敷料可以装载药物、蛋白质和细胞因子等物质。特别是金属纳米颗粒具有促进血管生成和抗菌的特性，从而增强治疗效果[14]。这些纳米材料可以用作智能递送系统，以改善治疗效果[15]。以下示例说明了治疗糖尿病伤口的方法：壳聚糖/聚乙烯醇/氧化锌纳米纤维垫[16]、铜金属-有机框架-水凝胶系统[17]、装载姜黄素纳米颗粒（CNPs@GMs）的明胶微球[18]、用铜/单宁酸纳米片增强的生物聚合物水凝胶[9]、用叶酸稳定的铜金属-有机框架纳米颗粒[19]、电纺聚（3-羟基丁酸酯-3-羟基戊酸酯）膜中掺入氧化铈纳米颗粒[20]、含有氧化铈纳米颗粒的壳聚糖/明胶水凝胶[21]、含有生物玻璃纳米颗粒的巯基化透明质酸/丝素纤维双重网络水凝胶[22]、掺银二氧化硅纳米颗粒的聚（乙二醇）二丙烯酸酯/透明质酸水凝胶[23]、嵌入ZnO纳米颗粒的海藻酸盐水凝胶[24]、含有黑色素增强剂的生物聚合物水凝胶[25]，以及含有Cu5.4O超小纳米酶的肝素基水凝胶[26]。

此外，先进技术的持续发展为治疗难以愈合的糖尿病伤口提供了使用组合生物材料的可能性。例如，研究人员研究了将水凝胶与外泌体（细胞分散时产生的微小颗粒）结合使用的方法，因为外泌体可以通过持续释放来调节慢性炎症、促进血管生成，并在长时间内增加糖尿病溃疡部位的细胞数量[27]。研究人员还发现，具有天然结构的仿生水凝胶比传统水凝胶具有更高的生物相容性和保湿性，从而加快糖尿病伤口的愈合速度。此外，研究人员开发了含有单原子铜-氮化碳（g-C₃N₄）纳米片的材料，这种材料在光激活下能引发多种级联反应，有效治疗感染的糖尿病伤口和相关多重耐药细菌感染[28]。最后，研究人员创造了等离子体超分子纳米酶生物鸡眼，利用其光热、抗氧化和抗菌作用联合治疗感染的糖尿病伤口[27] [29] [30]。

铜（Cu）是一种生物活性纳米颗粒，在多种细胞过程中起着关键作用，包括伤口愈合。它调节细胞因子和生长因子，影响其功能[31]。在受控条件下，铜已被证明可以促进细胞外基质（ECM）成分的表达、胶原蛋白合成和纤维蛋白原的生成。然而，过量摄入铜会导致自由基产生、脂质过氧化和细胞死亡[31]。尽管如此，人体通过调节内源性排泄来维持铜的平衡，防止其过量积累或缺乏[31]。由于铜对多种微生物具有抗菌作用，将其整合到支持结构中对于有效愈合至关重要[32]。海藻酸盐水凝胶因其出色的生物相容性和亲水性而受到欢迎。它们能创造湿润的伤口环境，促进糖尿病伤口的有效愈合[33]。此外，它们容易与其他物质交联，使其成为伤口管理的理想生物材料[34]。铜离子与水凝胶之间的相互作用通过范德华力和静电作用实现。水凝胶体积的减少会导致离子释放，促进细胞增殖和血管生成，从而加速伤口愈合[35]。这些敷料具有亲水性，有助于建立湿润的伤口环境，这是促进糖尿病伤口有效愈合的关键因素[33]。此外，这些材料容易与其他物质交联，从而在许多临床环境中促进伤口愈合过程。水凝胶的收缩会增强铜离子的释放，显示出其杀菌作用和伤口愈合益处[34]。抗菌铜-海藻酸盐敷料[36]、含有去铁胺和铜纳米颗粒的钙离子交联海藻酸钠水凝胶[37]、含有铜基金属-有机框架的羊膜/丝素纤维纳米支架[38]、装载纳米颗粒的海藻酸盐基材料[39]。

在我们之前的研究中，我们发现了Fe₃O₄@SiO₂/Schiff-碱基复合物与Cu(II)纳米颗粒的抗真菌能力[40]。我们设计了一种安全有效的策略，用于改善糖尿病患者的皮肤伤口愈合。本研究通过引入含有Fe₃O₄@SiO₂/Schiff-碱基复合物与Cu(II)纳米颗粒的海藻酸盐水凝胶敷料薄膜，提供了一种治疗糖尿病伤口的方法。该薄膜在较低浓度的Cu(II)纳米颗粒下也表现出体内伤口愈合效果。据报道，Fe₃O₄@SiO₂/Schiff-碱基复合物与Cu(II)纳米颗粒对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、大肠杆菌（Escherichia coli）和粪肠球菌（Enterococcus faecalis）具有抗菌效果。本研究将阐明Fe₃O₄@SiO₂/Schiff-碱基/Cu(II)薄海藻酸盐水凝胶薄膜在糖尿病伤口愈合中的潜在作用，包括促进上皮再生、胶原蛋白沉积、新生血管形成、肉芽组织形成和减少炎症，为临床糖尿病伤口治疗提供了一种有前景的策略。

材料与方法

四水合氯化铁（FeCl₂.4H₂O）、六水合氯化铁（FeCl₃.6H₂O）、氢氧化钠（NaOH）、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）、2-羟基苯甲醛（水杨醛）、四乙基正硅酸盐（TEOS）、四水合醋酸铜（Cu(OAc)₂.4H₂O）和3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES）均购自Sigma Aldrich（美国）。链脲佐菌素（STZ）、盐酸氯胺酮、赛拉嗪、二甲苯、甲醛、石蜡、苏木精和伊红（H&E）均从相应供应商处购买

SA-Fe₃O₄@SiO₂/Schiff-碱基/Cu(II)薄膜的制备

如方法部分所示，SA-Fe₃O₄@SiO₂/Schiff-碱基/Cu(II)薄膜的制备步骤如图1和图2所示。首先，在指定条件下使用FeCl₃.6H₂O、FeCl₂.4H₂O和CTAB合成Fe₃O₄ MNPs。然后，通过改良的St?ber技术，添加缩合TEOS作为二氧化硅源，制备了核壳结构的Fe₃O₄@SiO₂ MNPs。接着，在加入Cu(OAc)后，将APTES与水杨醛在乙醇中反应，制备了固态绿色Cu(II) Schiff碱基复合物

结论

总之，这项研究在糖尿病伤口护理领域取得了重要进展，证明了含有Fe₃O₄@SiO₂/Schiff-碱基复合物与Cu(II)纳米颗粒的海藻酸盐水凝胶的有效性。本研究的主要成就包括开发了一种新型复合材料，该材料具有生物相容性，铜纳米颗粒浓度适中，能够显著改善伤口愈合的多个方面，特别是上皮再生

CRediT作者贡献声明

萨雷赫·莫斯莱-希拉齐（Sareh Mosleh-Shirazi）：撰写 – 审稿与编辑、可视化、验证、概念化、数据分析、方法论、软件。阿里·穆罕默德·阿马尼（Ali Mohammad Amani）：撰写 – 审稿与编辑、可视化、验证、概念化、项目管理、软件、监督。埃斯马特·阿齐齐普尔（Esmat Azizipour）：撰写 – 审稿与编辑、软件、资源管理、数据分析、概念化、数据管理、方法论、可视化。法哈德·库赫佩伊玛（Farhad Koohpeyma）：撰写 – 审稿与编辑、软件、资源管理

利益冲突声明

? 作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。