EBF1的分子特征鉴定和功能分析揭示了其在尼罗罗非鱼B细胞免疫中的关键作用

《Fisheries Research》：Molecular characterization and functional analysis of EBF1 reveals its critical role in B-cell immunity in Nile tilapia

EBF1转录因子在尼罗 tilapia细菌免疫中的核心调控作用及其对B细胞分化的影响

　　

徐家义|黄永雄|黄宇|建志昌

广东海洋大学渔业学院，广东省水生动物疾病控制与健康养殖重点实验室，广东高等教育机构水生动物疾病控制重点实验室，湛江，524088，中国

摘要：

转录因子EBF1对B细胞发育和适应性免疫至关重要，但其在硬骨鱼类（尼罗罗非鱼）中的功能仍不清楚。在这项研究中，我们鉴定并表征了尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）中的On-EBF1基因。该基因的开放阅读框约为1.8 kb，编码一个含有保守的IPT和HLH结构域的599个氨基酸的核蛋白，其编码蛋白与其他硬骨鱼类的同源性超过80%，与哺乳动物的同源性超过70%。On-EBF1在脾脏中高表达，并特异性地在头部肾脏白细胞的B细胞亚群中表达。在无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）感染后，多个组织中观察到On-EBF1的表达上调，但在用无乳链球菌或嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila刺激24小时后，B细胞中的On-EBF1表达显著下调。在无乳链球菌感染后，体内沉默On-EBF1显著降低了鱼的存活率，伴随炎症失调、异常凋亡、补体系统紊乱以及关键B细胞分化因子（Pax5, CD19a/b, IgM, Blimp1）的组织特异性表达受损。总体而言，我们的研究结果表明On-EBF1是尼罗罗非鱼细菌免疫的核心调节因子，表明其严格调控的表达对于通过调节B细胞分化来实现适应性免疫至关重要。这项工作为了解低等脊椎动物的免疫网络提供了新的见解。

引言

Collier/Olf/EBF（COE）家族是一类独特的、进化上保守的转录因子，仅存在于后生动物中。其特征是一个高度保守的N端锌指DNA结合结构域和一个变化较大的C端功能结构域[1]。凭借这种独特的结构域组合，COE家族能够广泛参与并调节各种胚胎细胞类型的命运决定和分化过程，包括免疫系统、神经系统、骨骼系统和代谢系统中的细胞[2]、[3]、[4]、[5]、[6]。

这个转录因子家族在动物界中广泛分布，例如果蝇Collier和秀丽隐杆线虫UNC-3[7]、[8]。在脊椎动物中，COE基因通过全基因组复制事件分化为四个旁系基因（EBF1-4）[9]。在这些基因中，EBF1作为一种谱系特异性的转录因子，在脊椎动物物种的适应性免疫系统的发育和成熟中起着关键作用[10]。

研究表明，EBF1是B淋巴细胞分化的主调控因子[11]。功能缺失的EBF1会阻止B细胞发育到前B细胞阶段，伴随免疫球蛋白水平显著下降和生发中心形成严重受损。机制上，EBF1通过直接激活关键基因（如CD79a/b和Pax5）[12]、[13]、[14]来维持B细胞谱系的转录网络，这些基因在心脏发育、神经发生和代谢稳态、器官发生中起着关键作用[15]、[16]、[17]、[18]。

然而，尽管EBF1在哺乳动物适应性免疫中的作用已经得到充分证实，但在硬骨鱼类中的功能，特别是在细菌免疫中的作用仍很大程度上尚未探索。尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）是世界上最具有经济价值的淡水养殖鱼类之一，但细菌性疾病对其养殖造成了重大损失[19]。因此，了解尼罗罗非鱼的细菌免疫机制至关重要。本研究报道了尼罗罗非鱼中On-EBF1基因的鉴定，并建立了一个基因沉默模型，以研究On-EBF1敲低如何调节对细菌感染的免疫反应。探索On-EBF1敲低对宿主免疫反应和B细胞分化的调控作用，为深入理解硬骨鱼类的免疫和发育核心机制提供了重要的实验证据。

部分摘录

伦理声明

在整个研究过程中，严格遵守了《赫尔辛基宣言》规定的伦理准则。实验方案于2019年5月10日获得了广东海洋大学伦理委员会的批准。

鱼类准备

健康的尼罗罗非鱼（平均体重：45 ± 5克）来自位于广东省湛江的一个认证水产养殖设施。样本在1000升循环水产养殖系统中进行了30-45天的适应期

On-EBF1的特征

On-EBF1的开放阅读框（ORF）约为1800 bp，编码一个599个氨基酸的蛋白质，预测分子量为65.3 kDa，理论等电点（pI）为8.86（图1 A）。该蛋白质缺乏信号肽和跨膜结构域，但包含两个特征性的保守结构域：IPT和HLH（图1 B）。多重序列比对显示，On-EBF1与其他硬骨鱼类的同源性为87.67%-93.14%，与哺乳动物的同源性为79.44%-90.25%

讨论

作为关键的分子枢纽，EBF1协调先天免疫的激活、凋亡信号通路以及B淋巴细胞分化的转录重编程，从而调节有效清除病原体与免疫病理结果之间的平衡[10]、[14]、[24]。

在这项研究中，克隆并鉴定了尼罗罗非鱼的On-EBF1基因。On-EBF1基因的开放阅读框约为1800 bp，编码599个氨基酸

CRediT作者贡献声明

徐家义：概念构思、数据管理、初稿撰写。黄永雄：资源获取、验证。黄宇：项目管理、撰写、审稿与编辑。建志昌：撰写、审稿与编辑以及资金筹集。

资助

本研究得到了国家自然科学基金（编号：32573551）的支持

利益冲突声明

作者声明本研究在没有任何可能被视为潜在利益冲突的商业或财务关系的情况下进行。