龙胆碱（Sanguinarine）对肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）的抗菌机制及其在减少牛奶中细菌污染方面的效果

《Food and Bioproducts Processing》：Antibacterial Mechanism of Sanguinarine Against Klebsiella pneumoniae and Its Efficacy in Reducing Bacterial Contamination in Milk

SGCH对K. pneumoniae的抗菌机制及在牛奶中的灭活效果研究。通过显微观察、酶活性检测和乳污染实验，发现SGCH通过破坏细胞壁完整性、改变膜通透性、诱导ROS氧化损伤及抑制生物膜相关基因表达发挥多重抗菌作用，且对污染牛奶中K. pneumoniae存活率随时间呈显著降低趋势。

　　

王瑞英|韩亮刚|胡天龙|赵荣|李彦琳|普琪琪|曾菊|戴雄|张龙|辛吉格

中国云南省农业大学兽医学院兽医病原生物学重点实验室，昆明650201

摘要

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae，简称K. pneumoniae）是一种革兰氏阴性机会性病原体，在全球范围内广泛存在于动物源性食品中，对公共卫生构成重大威胁。长期使用抗生素加剧了抗生素耐药性问题。血根碱（Sanguinarine，简称SAN）是一种苯并菲啶类生物碱，其盐酸盐形式——血根碱盐酸盐（Sanguinarine hydrochloride，简称SGCH）具有显著的抗菌活性。然而，SGCH对K. pneumoniae的抗菌机制尚未完全阐明。本研究通过观察细菌微观结构、检测酶活性以及研究其对受污染牛奶的影响，探讨了SGCH的作用机制。结果表明，SGCH通过破坏细菌细胞完整性、改变膜通透性、引发细胞内氧化损伤以及下调与生物膜形成相关的基因表达来发挥抗菌作用。经12小时和24小时处理后，SGCH显著降低了受污染牛奶中K. pneumoniae的存活率。综上所述，SGCH可通过多种途径发挥抗菌效果，有效降低牛奶中K. pneumoniae的存活率。

引言

肺炎克雷伯菌（K. pneumoniae）是一种革兰氏阴性条件性致病微生物，在显微镜下通常呈现成对或短链状排列（Wang等人，2020年）。该菌广泛存在于自然环境中，可感染人类、外部环境和动物（Davis等人，2016年；Li等人，2024年；Holt等人，2015年；Riwu等人，2022年；Amorim等人，2017年）。值得注意的是，K. pneumoniae可能污染动物源性食品，从而增加人类感染的风险。在畜牧业中，K. pneumoniae可引发动物细菌性肺炎和乳腺炎，这两种疾病通常需要用抗生素治疗。尽管抗生素使用有效，但容易导致细菌产生耐药性。Bai等人（2024年）的研究发现，肉制品（2.7%）和农场动物（尤其是猪，4.6%）中存在碳青霉烯类抗生素耐药的K. pneumoniae（CRKP）。Dokuta等人（2025年）从泰国清迈动物市场采集了43份猪肉样本和33份鸡肉样本，经MALDI-TOF-MS鉴定发现，猪肉样本中产广谱β-内酰胺酶的E. coli和K. pneumoniae含量分别为46.51%和9.30%，鸡肉样本中分别为69.70%和6.06%。

中国传统草药已有数千年的应用历史，Macleaya cordata（简称MC）便是其中之一（Chen等人，2024年）。MC含有多种生物碱，如chelerythrine（CHE）、血根碱（SAN）、protopine（PRO）和allisatin（ALL），具有较大的开发潜力（Wang等人，2022年；Huang等人，2024年）。SAN是一种含氮有机化合物，属于菲啶类生物碱。为了提高稳定性，常将其转化为硫酸盐或氯化物形式，因为SAN本身带有正电荷，在水溶液中不稳定（Xin等人，2024年）。Hu等人（2022年）证明，SAN可破坏Candida albicans的细胞结构，导致细胞膜损伤并抑制真菌细胞内的麦角固醇合成，从而在体外发挥抗真菌作用。此外，SAN还能通过破坏细菌细胞壁和膜完整性、诱导活性氧（ROS）产生及抑制生物膜形成来发挥抗菌作用（Gu等人，2023年；Zhang等人，2020年）。Lu等人（2022年）发现，SAN与氨基糖苷类联合使用对E. coli、Acinetobacter baumannii、K. pneumoniae和Pseudomonas aeruginosa具有协同抗菌效果。这些发现为进一步研究SAN的抗炎和抗菌特性奠定了基础。

目前已有大量关于中药活性成分对K. pneumoniae抗菌效果的研究报告。例如，Qian等人（2021年、2020年）发现丁香酚可通过破坏细菌细胞膜和结构抑制CRKP的生物膜形成；Paeonol也能抑制K. pneumoniae的生物膜形成、抑制细菌生长并破坏细胞膜完整性。Chen等人（2023年）指出，Monarda didyma精油（MDEO）能调节CRKP的生物膜形成，同时诱导细胞膜损伤和细胞内大分子释放；后续研究显示，MDEO可通过抑制PPP和TCA途径中的关键酶（如葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、柠檬酸合成酶、异柠檬酸脱氢酶和α-酮戊二酸脱氢酶）发挥抗菌作用。Marcia Soares Mattos Vaz等人（2023年）发现肉桂醛能抑制多重耐药K. pneumoniae（MDR Kp）的生长。Walaa A. Negm等人（2021年）发现Cycas thouarsii R.Br.叶提取物可通过抑制K. pneumoniae生长、破坏细胞膜完整性、降低内外膜通透性及诱导细胞形态改变来发挥抗菌作用。

目前关于生物碱对K. pneumoniae抗菌效果的研究文献较少。因此，本研究选择以血根碱盐酸盐（SGCH）作为研究对象。本研究的主要目的是通过评估SGCH对细菌形态、酶活性、细胞壁完整性、细胞膜功能、ROS水平以及与生物膜形成相关基因表达的影响，来探讨其抗菌效果，为含SGCH的药品开发和应用奠定基础。

实验部分

菌株和生物碱

本实验使用的K. pneumoniae [CMCC(B)46117]由中国昆明海关技术中心动物检疫实验室提供。首先，将含有K. pneumoniae的磁珠放入含有5 mL LB培养基的无菌试管中，随后将试管置于37°C、150 rpm、轨道幅度为20 mm的摇床中培养过夜。次日，将过夜培养的细菌悬液进行稀释

SGCH对K. pneumoniae的抑菌圈直径

所有测试浓度的SGCH均能有效抑制K. pneumoniae的生长，氯四环素盐酸盐（Chlortetracycline hydrochloride）作为阳性对照。SGCH在1000 μg/mL、500 μg/mL和250 μg/mL浓度下的抑菌圈直径分别为9.23 mm、6.7 mm和5.71 mm，表明其抑菌效果具有浓度依赖性（表2，图1）。然而，这三个浓度的SGCH抑菌圈直径均明显小于阳性对照

讨论

血根碱（SAN）是MC中的主要活性成分，具有广谱抗菌活性，对大多数革兰氏阳性和阴性球菌及杆菌均有效。本研究旨在探讨SAN对K. pneumoniae的抗菌作用机制。抑菌圈实验结果及MIC和MBC测定表明，SAN对K. pneumoniae具有优异的抗菌效果。

结论

SGCH对K. pneumoniae表现出强烈的抗菌活性，其作用机制包括破坏细胞壁和膜、诱导ROS产生、抑制生物膜形成以及下调与生物膜形成相关的基因表达。此外，SGCH能有效降低牛奶中K. pneumoniae的存活率，显示出作为传统抗生素替代品的潜力。

作者贡献声明

辛吉格（Jige Xin）：撰写、审稿与编辑、项目监督、资金获取、概念构思。韩亮刚（Diangang Han）：撰写、审稿与编辑、实验设计、资金获取、概念构思。王瑞英（Ruiying Wang）：初稿撰写、方法学设计、数据分析。张龙（Long Zhang）：资源协调。戴雄（Xiong Dai）：数据分析。曾菊（Ju Zeng）：数据管理。赵荣（Rong Zhao）：数据可视化与软件处理。胡天龙（Tianlong Hu）：数据管理。普琪琪（Qiqi Pu）：方法学设计。李彦琳（Yanlin Li）：数据验证与实验实施

未引用参考文献

Amorim和Janaína-dos Santos，2017年；Borisov等人，2021年；Chen等人，2023年；Davis和Price，2016年；Heuser等人，2022年；Ke等人，2023年；Negm等人，2021年；Qian等人，2020年；Vaz等人，2023年。

伦理声明

本研究未涉及人类参与者或动物实验。

利益冲突声明

作者声明不存在可能影响本研究结果的财务利益或个人关系。

数据获取

数据可应要求提供。

利益冲突声明

所有作者均声明不存在利益冲突，无需披露任何相关信息。

致谢

本研究得到了云南省高层次人才支持计划（YNWR-QNBJ-2020-154）、云南省专家工作站（202505AF350101）、云南省兽医公共卫生联合国际研发中心（202403AP140033）以及云南省兽医病原生物学重点实验室（202449CE340019）的支持。