《Food and Bioproducts Processing》：Cyanidin-3-rutinoside(C3R) Attenuates Free Fatty Acid-Induced Hepatic Lipid Accumulation in HepG2 Cells
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非酒精性脂肪肝中C3R通过多靶点机制调节胆固醇代谢和自噬，抑制SREBP2介导的胆固醇合成，激活PCSK9/LDLR通路促进清除，上调PPARγ-CYP7A1促进胆酸合成，同时诱导自噬降解脂滴，分子对接显示与INSIG1、PCSK9、PPARγ高亲和力结合。
Jingxu Duan|Wancong Yu|Yujia Niu|Jiao Li|Zhaohui Xue
天津大学合成生物学国家重点实验室，中国天津，300072
摘要
非酒精性脂肪肝病（NAFLD）的特征是肝细胞中脂质异常积累。天然花青素——氰苷-3-鼠李糖苷（C3R）在游离脂肪酸（FFA）诱导的HepG2脂肪变性模型中减轻了脂质积累。它显著降低了细胞内甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）的水平，抑制了脂滴的形成，并通过增强超氧化物歧化酶（SOD）/过氧化氢酶（CAT）的活性以及增加谷胱甘肽（GSH）的含量来缓解氧化应激，同时降低了丙二醛（MDA）和活性氧（ROS）的水平。RNA测序分析显示，C3R逆转了FFA诱导的转录组变化。机制上，C3R抑制了固醇调节元件结合蛋白2（SREBP2）介导的胆固醇合成，激活了前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin 9型（PCSK9）/低密度脂蛋白受体（LDLR）通路以促进胆固醇清除，并上调了过氧化物酶体增殖激活受体γ（PPARγ）依赖的细胞色素p450家族7亚家族成员1（CYP7A1）的表达，从而刺激胆固醇转化为胆汁酸。C3R还增强了自噬过程，促进了脂滴的降解。分子对接证实C3R与胰岛素诱导基因1（INSIG1）、PCSK9和PPARγ具有高亲和力结合，其羟基在活性位点形成了特定的氢键，支持了直接靶向作用。这些发现建立了C3R改善肝脂肪变性的多靶点机制，为花青素调节脂质代谢提供了分子基础。
引言
NAFLD被定义为一种以肝细胞中脂质过度积累为特征的代谢性疾病（Younossi等人，2023年；Yu等人，2019年）。最近，该疾病被重新分类为更广泛的诊断术语——代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）（Rinella等人，2023年）。尽管其全球发病率正在上升，但目前的治疗策略仍然有限。天然产物已成为有希望的干预候选物，如黄酮类（例如花青素、槲皮素、山柰酚）、生物碱（例如小檗碱、甜菜碱）和萜类（例如木犀草素、乳香酸）等化合物显示出潜在的有效性（Seo等人，2024年；Shen等人，2022年；Wei等人，2016年；Zhao等人，2025年）。因此，迫切需要开发安全、有效且可靠的天然生物活性剂来管理NAFLD。其中，花青素因其在调节脂质代谢和减缓NAFLD进展方面的积极作用而显示出特别的前景。
C3R是一种天然存在的花青素，在树莓和蓝莓等浆果中含量丰富，在室温下呈红紫色结晶粉末。它具有水溶性，但在乙醇和其他酒精溶剂中的溶解度有限，并且对光和热敏感。通常从植物来源中提取并通过一系列处理步骤纯化，不同浆果中的C3R浓度差异很大：干甜樱桃提取物中为0.226 mg/g（Gon?alves等人，2018年），Cornelian cherry提取物中为241.21 mg/100 g（Dumitra?cu等人，2019年），冻干桑葚中为0.01–12.93 mg/g（Zheng等人，2016年），黑加仑中为7.8–42.22 mg/100 g（Castro-Acosta等人，2016年），新鲜荔枝果皮中为0.429 ± 0.068 mg/g（Sarni-Manchado等人，2000年）。研究表明，C3R具有抗氧化、抗高血糖和心脏保护作用。体外研究进一步证明它可以通过抑制胰脂肪酶和胆固醇酯酶的活性以及减少Caco-2细胞中的胆固醇摄取来调节脂质的消化和吸收（Thilavech & Adisakwattana，2019年）。然而，关于C3R调节脂质代谢的全面调控网络及其确切机制，尤其是其在改善肝脂质积累方面的潜力，仍存在显著空白。
胆固醇是哺乳动物体内的主要固醇，是细胞膜的重要结构成分，调节膜流动性，并作为胆汁酸和类固醇激素的前体。通过内源性合成、外源性摄取、外排和酯化来维持胆固醇代谢的稳态对细胞和有机体的功能至关重要（Bao等人，2023年）。这种平衡的破坏与心血管疾病、脑血管疾病、代谢性疾病（包括非酒精性脂肪肝病）、神经退行性疾病和癌症的发病机制密切相关。胆汁酸是肝脏中胆固醇的主要代谢产物，有助于肠道脂质的吸收和运输，同时作为信号分子和炎症介质激活核受体和细胞通路。胆固醇转化为胆汁酸是调节全身胆固醇水平的关键机制，从而有助于降低血清胆固醇并维持脂质稳态。例如，Yan等人报告说，染料木素可以下调限速酶CYP7A1，从而抑制NPC1样细胞内胆固醇转运蛋白1（NPC1L1）的表达并促进胆固醇的转运（Yan等人，2024年）。同样，Liu等人证明，来自茜草科的鸢尾苷可以通过抑制法尼醇X受体（FXR）介导的负反馈来增强肝脏胆汁酸的合成，从而促进通过胆汁酸-肠肝轴的胆固醇排泄（Liu等人，2020年）。
尽管C3R表现出调节脂质的活性，但其全面的调控网络和改善肝脂质积累的精确分子机制仍不完全清楚。本研究旨在系统地阐明C3R对抗肝脂肪变性的多靶点机制，特别关注其对胆固醇代谢（合成、摄取和胆汁酸转化）和自噬的整合调节。我们的发现为花青素在代谢性肝病中的治疗潜力提供了新的分子基础。
材料和化学品
人肝细胞癌细胞系HepG2购自上海福恒生物技术有限公司。Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）和0.25%胰蛋白酶-EDTA购自Thermo Fisher Scientific（美国）。磷酸盐缓冲盐水（PBS）购自北京Solarbio科技有限公司。C3R（纯度≥98%，批号#WP23101111）购自四川Vicki生物技术有限公司。为确保实验一致性，使用了同一批次（批号#WP23101111）的C3R。
FFA和C3R对细胞活力的影响
为了评估C3R对HepG2细胞活力的影响，将细胞暴露于逐渐增加浓度的C3R中48小时，并使用CCK-8检测法测量细胞存活率。如图1A所示，浓度高达100 μmol/L的C3R可使细胞活力保持在90%以上，而200 μmol/L的C3R则使细胞活力降至90%以下。基于这一安全性特征，选择了25、50和100 μmol/L的C3R浓度，在500 μmol/L FFA的存在下评估其效果。图1B显示，所有联合处理
结论
总之，本研究表明，C3R通过协调的多靶点机制缓解肝脂质积累：通过SREBP2/HMGCR信号通路抑制内源性胆固醇合成；通过激活PCSK9/LDLR通路促进LDL-C的清除；通过PPARγ-CYP7A1介导的胆汁酸排泄通路促进胆固醇转化为胆汁酸；并通过诱导自噬促进细胞内脂质的降解。这些综合发现为
CRediT作者贡献声明
Jingxu Duan：写作——审稿与编辑，撰写初稿，数据可视化，方法验证，实验设计，数据分析，数据管理。Yujia Niu：方法设计，实验设计，数据管理，概念构思。Wancong Yu：项目监督，项目管理。Zhaohui Xue：写作——审稿与编辑，项目监督，资源获取，资金申请，概念构思。Jiao Li：资源管理，实验设计，数据分析
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
数据可用性
本研究中生成的原始RNA-seq数据已存入GEO数据库，访问号为GSE316562。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
本研究得到了国家自然科学基金（编号31571825）、天津大学自主创新基金（2025XC-0001）和2024年研究生国际教学体系建设项目（ENT24004）的支持。
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