《Food Chemistry: Molecular Sciences》：Effect of canopy height and tree shape on anthocyanins accumulation in wine grape
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本研究针对葡萄果实色泽与品质受冠层管理影响但分子机制不明的问题，整合代谢组学与转录组学技术，探讨了不同冠层高度对酿酒葡萄花色苷积累的影响。研究揭示了提高冠层高度可显著提升果实花色苷含量，并通过调控类黄酮生物合成通路中的关键结构基因和转录因子（如FAOMT、FLS、WRKY等）来促进其生物合成。这为通过精准冠层管理提升酿酒葡萄品质提供了重要理论依据和遗传靶点，对葡萄栽培实践和育种具有指导意义。
红酒那令人沉醉的色泽，很大程度上来源于葡萄皮中丰富的天然色素——花色苷。这些物质不仅决定了葡萄酒的感官品质，还赋予了其独特的抗氧化特性。在葡萄栽培中，果农们常常通过调整葡萄树的冠层结构（如高度、形状）来改善光照和微气候，以期获得颜色更深、风味更佳的果实。实践中也观察到，较高的冠层往往与更深的果实颜色相关。然而，这种栽培措施背后隐藏着一个关键的科学问题：冠层高度的变化究竟是如何从分子层面影响葡萄果实中花色苷的合成与积累的？此前的研究往往将栽培措施、生理响应和分子机制分开探讨，对于冠层高度这一关键栽培技术如何调控花色苷合成关键基因的表达，从而最终影响葡萄果实着色，尚缺乏系统而深入的研究。这一知识缺口制约了葡萄定向育种和精准栽培策略的发展。为了解开这个谜题，宁夏农林科学院园艺研究所的研究团队在《Food Chemistry: Molecular Sciences》上发表了一项研究，他们通过整合代谢组学和转录组学分析，系统探究了不同冠层高度下葡萄果皮花色苷合成的关键基因与调控网络。
为了开展这项研究，研究人员采用了几个关键的技术方法。他们在中国宁夏贺兰山东麓的金山试验区，选取了11年生的‘赤霞珠’、‘西拉’和‘小味儿多’三个酿酒葡萄品种作为实验材料。研究设置了80厘米、110厘米、140厘米和170厘米四个冠层高度处理。在果实转色期，研究人员采集了葡萄浆果样本，并选择了表型对比最显著的两个极端冠层高度（80厘米与170厘米）处理组的子集样本进行后续分析。研究核心技术包括：1）利用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）技术对葡萄浆果中的花色苷代谢物进行定性和定量分析（代谢组学）；2）对样本进行链特异性RNA测序（RNA-seq），以分析基因表达差异（转录组学）；3）通过实时定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）对从转录组数据中筛选出的8个与花色苷代谢相关的候选基因进行表达验证；4）运用主成分分析（PCA）、差异表达基因（DEGs）分析、基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析，以及皮尔逊相关性分析等生物信息学方法，整合代谢组与转录组数据，揭示其内在关联。
3. 结果
3.1. 花色苷含量的测定
研究首先测定了不同冠层高度下葡萄浆果的花色苷水平。结果显示，与80厘米冠层高度相比，在170厘米高度下，所有三个品种的浆果花色苷含量均增加了至少2.1倍 。这一发现证实了提高冠层高度能显著促进花色苷积累，为后续的组学分析奠定了基础。
3.2. 代谢组学分析
3.2.1. 葡萄代谢物的整体分析
通过LC-MS/MS技术，研究人员在三个葡萄品种的转色期浆果中共鉴定并定量了36种花色苷代谢物。总离子流（TIC）叠加图和变异系数（CV）分析表明数据稳定可靠。基于标准化代谢物数据的层次聚类热图显示，代谢物可聚为几类，包括花青素、芍药素、飞燕草素、原花青素、锦葵素、黄酮类和矮牵牛素等。
3.2.2. 不同冠层高度下的代谢物分析
通过比较同一品种在不同冠层高度下的代谢物谱，研究人员鉴定出多个差异积累代谢物。在‘赤霞珠’（CS-170 vs CS-80）和‘西拉’（Sy-170 vs Sy-80）中分别鉴定出26个，在‘小味儿多’（PV-170 vs PV-80）中鉴定出19个。其中，有15个差异代谢物为三个比较组所共有。分析发现，花色苷-3-O-葡萄糖苷、锦葵素-3-O-葡萄糖苷和芍药素-3-O-葡萄糖苷等关键花色苷在较高冠层（170厘米）下的相对含量显著上升，而一些原花青素（如原花青素B1、B2等）的含量则下降 。花青素-3-O-葡萄糖苷、芍药素-3-O-葡萄糖苷、锦葵素-3-O-葡萄糖苷和花青素-3-O-阿拉伯糖苷-葡萄糖苷这四种花色苷在所有三个品种中均表现出一致的差异积累模式，表明它们是响应冠层高度增加的核心代谢响应物。
3.2.3. 差异代谢物KEGG富集分析
对差异代谢物进行KEGG（京都基因与基因组百科全书）通路富集分析发现，在所有三个比较组中，最显著富集的通路均涉及“花色苷生物合成”、“次生代谢物合成”、“类黄酮生物合成”和“代谢通路”。这表明冠层高度的增加显著影响了代谢过程，特别是与花色苷和类黄酮生产相关的通路。
3.3. 转录组学分析
3.3.1. 转录组测序数据分析
测序数据质量高，各样本比对到参考葡萄基因组的效率超过90%。生物学重复间表现出极好的一致性，适合进行后续分析。
3.3.2. 差异表达基因（DEGs）的整体分析
主成分分析（PCA）显示，样本根据冠层高度清晰聚类 。差异表达分析（阈值：|log2FoldChange| ≥1，错误发现率FDR < 0.05）表明，不同冠层高度引起了显著的转录重编程。CS-80 vs CS-170比较组鉴定出2370个DEGs，Sy-80 vs Sy-170组有2858个，PV-80 vs PV-170组最多，达3007个。其中PV组对冠层高度变化的转录响应最为显著。
3.3.3. 基因本体（GO）富集分析
GO富集分析显示，DEGs在生物过程（BP）类别中主要与“细胞过程”、“代谢过程”、“对刺激的反应”等相关；在细胞组分（CC）和分子功能（MF）类别中也各有富集。在PV组的富集分析中，与“光合作用”、“前体代谢物和能量的产生”、“类黄酮代谢过程”等相关的通路表现出高富集度。三个比较组共同显著富集的15条通路表明，光合过程在葡萄花色苷积累中扮演关键角色，且与类黄酮和乙烯代谢密切相关 。
3.3.4. DEGs的KEGG富集分析
KEGG富集分析进一步证实，DEGs在“代谢通路”、“次生代谢物的生物合成”、“植物激素信号转导”、“类黄酮生物合成”和“光合作用-天线蛋白”等通路上普遍富集。各品种也表现出独特的富集模式。总共鉴定出258个共有差异表达基因，它们主要涉及碳水化合物代谢、脂质代谢、氨基酸代谢、能量调控、次生代谢物生物合成、环境适应和信号转导等通路。与花色苷生物合成通路特异相关的基因如表S4所示。
3.4. 葡萄花色苷生物合成相关基因的表达分析
3.4.1. 类黄酮、黄酮醇、类黄酮和花色苷生物合成
分析发现，多个参与类黄酮、黄酮醇和花色苷生物合成的基因表达存在差异。在170厘米冠层高度下，包括FAOMT（类黄酮-3’,5’-甲基转移酶）、C75A3、FLS（黄酮醇合酶）、HCT1（羟基肉桂酰-CoA莽草酸/奎宁酸羟基肉桂酰转移酶）、UFOG、CFI2（查尔酮黄烷酮异构酶）、CHS2（查尔酮合酶）、FL3H（黄烷酮3-羟化酶）、BEATH、C75A1和LDOX（无色花青素双加氧酶）在内的基因表达显著上调。相反，UFOG3、URT1、U91C1和SHT等基因在80厘米低冠层下的表达量显著更高 。
3.4.2. 植物次生代谢物的生物合成
在与次生代谢物生物合成相关的通路中，包括C82C4、C82A3、BGL18、BGL12、NAS、U90A1、ACCH1和MER在内的基因在80厘米低冠层高度下表达水平 consistently更高，表明在此条件下次生代谢活动活跃 。
3.4.3. 转录因子
对转录因子的分析识别出来自WRKY、GRAS、bZIP（碱性亮氨酸拉链）、bHLH（碱性螺旋-环-螺旋）、AUX/IAA、GARP、Tify、B3-ARF和SET等多个家族的成员。其中，WRKY转录因子在‘赤霞珠’和‘夏黑’葡萄的170厘米冠层下表达较高，而在‘小味儿多’中则是在80厘米冠层下表达显著更高。其他家族的转录因子则普遍在低冠层下表达更高 。
3.5. 花色苷积累的代谢组学和转录组学整合分析
为了深入理解不同冠层高度差异调控葡萄花色苷合成的分子机制，研究人员对代谢组和转录组数据进行了整合分析。他们计算了差异积累代谢物与花色苷生物合成通路中差异表达基因之间的皮尔逊相关系数。关键发现包括：花青素-3-O-葡萄糖苷与芍药素-3-O-葡萄糖苷呈极显著正相关，而与花青素-3-O-阿拉伯糖苷-葡萄糖苷呈显著负相关。在基因表达水平，花青素-3-O-葡萄糖苷与Vitvi01g02263（FAOMT）、Vitvi01g04436（FAOMT）和Vitvi05g00018（MER）等基因的表达呈显著正相关。这些相关性分析揭示了代谢物积累与特定基因表达之间的潜在调控关系。
3.6. RT-qPCR验证结果
为了验证转录组测序结果，随机选取了8个参与花色苷合成的差异表达酶基因进行qRT-PCR分析。结果证实了RNA-seq数据在不同叶冠高度下观察到的表达模式，确保了转录组数据的可靠性 。
4. 讨论与结论
本研究通过整合代谢组学和转录组学分析，系统揭示了冠层高度调控酿酒葡萄花色苷积累的分子机制。主要结论和意义如下：
首先，研究证实了提高冠层高度（从80厘米增至170厘米）能显著促进三个酿酒葡萄品种（‘赤霞珠’、‘西拉’、‘小味儿多’）果实中花色苷的积累，含量提升至少2.1倍。这从生理表型上验证了优化冠层管理作为促进果实着色的有效农艺措施的可行性。
其次，在分子机制层面，研究发现了对不同冠层高度响应的核心代谢物和关键基因。四种花色苷（花青素-3-O-葡萄糖苷、芍药素-3-O-葡萄糖苷、锦葵素-3-O-葡萄糖苷和花青素-3-O-阿拉伯糖苷-葡萄糖苷）在所有品种中均表现出一致的差异积累，是响应冠层微环境变化的核心代谢物。通路富集分析表明，冠层高度的影响主要集中在“花色苷生物合成”、“类黄酮生物合成”和“次生代谢物合成”等通路。
更重要的是，研究鉴定出一系列与花色苷合成密切相关的差异表达基因。在较高冠层下，FAOMT、C75A3、FLS、HCT1、UFOG、CHS2、FL3H、LDOX等类黄酮/花色苷生物合成通路中的关键结构基因表达上调，这与花色苷含量的增加相一致。例如，FAOMT基因的表达与花青素-3-O-葡萄糖苷和锦葵素-3-O-葡萄糖苷含量呈正相关，提示其在冠层高度调控的花色苷甲基化修饰中可能起重要作用。同时，一些基因（如UFOG3、URT1、BGL等）在低冠层下表达更高，可能作为花色苷合成的负调控因子。
此外，研究还发现多个转录因子家族（如WRKY、bHLH、GRAS、bZIP、AUX/IAA、GARP、Tify等）的表达受冠层高度调控。特别是在‘赤霞珠’和‘夏黑’中，WRKY转录因子在较高冠层下表达上调，而其他家族转录因子多在低冠层下表达更高，暗示了复杂的转录调控网络参与了对冠层微环境的响应。
综上所述，这项研究不仅从实践角度证实了提高冠层高度作为一项有效的栽培措施可以促进葡萄果实着色和品质提升，更重要的是从分子层面阐明了其作用机制：即通过调控类黄酮生物合成通路中的关键结构基因（如FAOMT、CHS2、LDOX等）以及WRKY等重要转录因子的表达，来促进花色苷的合成与积累。该研究填补了冠层管理影响葡萄色泽的分子机制研究空白，为通过精准农业和分子育种手段定向改良葡萄花色苷含量、提升葡萄酒品质提供了重要的理论依据和具体的候选基因资源。然而，作者也指出，本研究仅分析了少数品种，且候选基因的功能尚未在体内外验证。未来的研究将侧重于通过功能基因组学方法验证这些候选基因，并开发分子标记以支持选育富含花色苷的葡萄品种。同时，在实际栽培中，估算葡萄花色苷含量时还需综合考虑气候、植物光合作用及栽培区域的日灼病等综合因素。
