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本研究通过虚拟筛选和细胞/zebrafish模型验证，发现软壳龟水解肽P1和P7通过TLR4/MD2抑制炎症因子，P1调控NF-κB通路，P7影响神经炎症通路，并具有调节肠道菌群和预生物特性。
吴月|王甘林|史丽华|朱轩|严富杰
浙江大学医学院附属第一医院老年病科，中国杭州310003
摘要
软壳龟（Pelodiscus sinensis）因其营养价值和药用特性而备受推崇，是生物活性肽的优质来源。本研究阐明了软壳龟肽的免疫调节机制。通过虚拟筛选，这些肽序列被检测是否能与Toll样受体（包括TLR4/MD2）结合。在细胞模型和斑马鱼模型中的进一步验证发现两种具有强抗炎作用的肽：P1（PGPSGLIGPA）和P7（PASAPAPAPA）。这两种肽均能显著抑制巨噬细胞中LPS诱导的一氧化氮、TNF-α和IL-6的产生。转录组分析显示，P1主要调节NF-κB通路，而P7则影响与神经炎症相关的通路。此外，利用体外肠道模拟模型，我们证明了它们的益生元样潜力。这两种肽能够对抗由菌群失调引起的丙酸和丁酸水平升高，其中P7还能增强微生物的α多样性。这些发现首次证明了这些特定软壳龟衍生肽具有双重免疫调节和调节肠道微生物群的功能，凸显了它们作为功能性食品成分的潜力。
引言
软壳龟（Pelodiscus sinensis）是一种两栖爬行动物，在中国传统饮食和医学中备受重视，其肉质富含蛋白质、不饱和脂肪酸、微量元素和其他必需营养素（Hou等人，2024；Wang等人，2021）。酶解法可将龟肉蛋白转化为安全、高纯度且具有生物活性的软壳龟肽（STPs）。这些水解产物主要由低分子量肽组成，富含脯氨酸、赖氨酸和亮氨酸（Islam等人，2025），并具有抗氧化、免疫调节、抗癌和抗炎等多种生物活性（Wang等人，2022）。研究表明，STPs可通过激活NRF2/KEAP1通路增强小鼠的抗疲劳能力（Zhong等人，2022）。史丽华等人（2021）发现STPs能提高果蝇和衰老小鼠的超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）活性，同时降低丙二醛（MDA）含量，从而保护细胞免受氧化损伤，并展现强大的抗氧化能力。庄等人（2023）报道，膳食补充STPs可激活AHR/IL-22/STAT3/IL-6信号通路，从而增强IgA反应并强化肠道屏障功能。
分子对接是一种广泛应用于药物发现研究的理论模拟方法，特别是用于识别新的活性生物分子（如生物活性肽）。Toll样受体（TLRs）在多种炎症、自身免疫和神经退行性疾病中起着关键作用。尤其是TLR4，因其潜在的治疗价值而受到广泛关注（Xu等人，2024）。因此，许多研究通过TLR4来筛选具有免疫调节作用的肽。例如，从519种驴皮明胶水解肽中通过TLR4/MD2复合体靶向分子对接筛选出了两种免疫调节肽（VQLSGEEK和GFSGLDGAKG），其双向免疫调节活性通过细胞实验得到证实（Yu等人，2023）。此外，从Rana spinosa水解物中还发现了三种新的免疫调节肽（GIHETTYNS、IADRMQKE、IVRDIKEK）。这些肽通过TLR4/MD2结合作用于关键位点，增强RAW264.7巨噬细胞的活性，表现出强烈的细胞因子/ROS诱导作用，并在计算机模拟中显示出良好的稳定性（Zeng等人，2025）。
肠道微生物群包括居住在人体肠道中的细菌、真菌、病毒和其他微生物，与宿主健康密切相关。这些微生物参与多种生理过程，如食物消化、营养吸收和维生素合成（Yan等人，2024；Yan等人，2024）。肠道微生物群对免疫调节至关重要，通过微生物代谢物和直接细胞相互作用影响免疫系统的发育和功能。例如，某些益生菌通过激活免疫细胞反应来增强宿主免疫力。重要的是，膳食肽可以通过调节微生物群的结构和代谢活性进一步促进肠道和全身健康（Dong等人，2025）。研究表明，鹿角肽可通过增强有益菌群和优势菌门的比例来调节肠道微生物群组成，同时调节脂质代谢并展现抗衰老作用（Liu等人，2021；Sun等人，2025；Sun等人，2025）。廖等人（2019）研究了32种商业抗菌肽补充剂对Litopenaeus vannamei的生长、抗菌免疫和肠道微生物群的影响，发现肽S100能有效促进生长、增强抗菌免疫和改善肠道微生物群结构。从乳清蛋白中提取的三肽Pro-Glu-Trp可通过促进肠道尿酸排泄、调节肠道微生物群和恢复肠道屏障功能来缓解高尿酸血症（Qi等人，2024）。然而，水解龟肽与肠道微生物生态及免疫调节之间的相互作用尚未得到充分研究。
因此，为填补STPs中特定免疫调节序列及其作用机制的空白，本研究旨在系统地发现并表征来自这种来源的抗炎肽。我们采用了一种综合策略，结合了对关键先天免疫受体（包括TLR4/MD2和TLR2家族成员的计算机模拟筛选，随后在细胞和斑马鱼模型中进行功能验证。目的是识别潜在的候选肽，通过转录组分析阐明其主要抗炎信号通路，并利用体外模拟系统进一步研究其调节肠道微生物群的潜力。这种多方面的方法全面评估了STPs的功能潜力，为它们作为健康促进成分的未来应用提供了科学依据。
材料与试剂
所有用于细胞实验的九种肽均由上海宏泰生物科技有限公司合成，纯度超过98%，通过HPLC验证。聚苯乙烯（PS）微球（直径3微米）购自天津贝思乐科技有限公司。脂多糖（LPS）购自Sigma公司。一氧化氮（NO）检测试剂盒和CCK-8试剂盒购自贝泰姆生物科技有限公司。ELISA试剂盒用于肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-6（IL-6）的定量检测。
免疫调节肽的筛选与选择
为了从STPs中识别潜在的免疫调节肽，采用了计算机模拟分子对接方法，最初关注TLR4/MD2复合体——这一关键受体系统介导LPS诱导的炎症信号（Krüger等人，2017）。对接位点的选择基于已建立的结构生物学知识。TLR4/MD2复合体内的大型疏水口袋是LPS脂质A部分的主要结合位点，该口袋的占据对于受体功能至关重要。
结论
本研究通过结合计算机模拟对接和细胞及斑马鱼模型中的功能验证，成功从STPs中鉴定出两种新的免疫调节肽。这两种肽通过抑制巨噬细胞中LPS诱导的关键炎症介质的产生，并改善斑马鱼肠炎模型的存活率，显示出显著的抗炎效果。转录组分析揭示了不同的作用机制。
CRediT作者贡献声明
吴月：撰写——初稿撰写、验证、实验设计、数据整理。王甘林：数据可视化、验证、实验设计、数据分析。史丽华：实验方法、实验设计、数据分析。朱轩：撰写——审稿与编辑、概念构思。严富杰：撰写——审稿与编辑、项目监督、实验方法设计。
未引用参考文献
Duan, Wang, Huangfu and Li, 2023
Hou et al., 2025
Islam et al., 2021
Kuznik, Chalisova and Guseva, 2022
Mohanty and Mohanty, 2023
van Teijlingen et al., 2020
Zhang and Huang, 2025
Zhou et al., 2023
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
