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本研究利用大肠杆菌原核表达系统成功合成重组虾肌肉动蛋白（rTM），并通过紫外、荧光及圆二色光谱分析证实其与天然虾肌肉动蛋白（nTM）结构高度相似。基于rTM的动物实验显示两者具有等效过敏原性。进一步开发普鲁士蓝纳米颗粒（PBNPs）标记的侧流免疫层析法（LFIA），其检测灵敏度达0.051 μg/mL，特异性、准确性和重复性优异，为虾过敏原快速检测和标准化替代品研发奠定基础。
余春迪|张颖|马泽坤|艾什法克·艾哈迈德|徐天蛟|杨青丽|吕良涛
青岛农业大学食品科学与工程学院，中国青岛，266109
摘要
原肌球蛋白（TM）是主要的虾类过敏原，对食品安全构成了重大挑战。本研究旨在开发一种生物合成的重组原肌球蛋白（rTM），作为天然原肌球蛋白（nTM）的标准化替代品，并建立一种灵敏的检测方法。通过紫外光谱、荧光光谱和圆二色光谱分析，证实了rTM与nTM之间的高度相似性。在鼠模型中进一步验证了它们相当的致敏性。随后开发了一种新型侧向流动免疫测定法（LFIA），使用普鲁士蓝纳米颗粒（PBNPs）作为探针。该测定法的线性范围为0.1–50 μg/mL，检测限为0.051 μg/mL，在添加了过敏原的食品基质中表现出优异的特异性、准确性和精度。这项工作为开发nTM的替代品奠定了基础，并提供了一个可靠、便携的检测大分子食品过敏原的平台。
引言
食物过敏已成为全球范围内的一个重要公共卫生问题。水产品因其丰富的营养价值和独特的风味而受到欢迎，但与之相关的过敏反应发病率每年都在增加（Pavase等人，2021年）。虾是最常见的致敏性水产品之一，影响了全球约2.5%的人口（Zhao等人，2023年）。虾中的主要过敏原是原肌球蛋白（TM），这是一种水溶性、热稳定的蛋白质，可介导IgE依赖的免疫反应（Chinnappan等人，2020年；Zhou等人，2023年）。虾TM过敏可引起荨麻疹、腹泻、皮炎等症状，在严重情况下甚至可能导致过敏性休克，危及生命（Jiao等人，2024年）。研究表明，至少80%的虾过敏患者对TM有免疫反应（Chen等人，2025年）。鉴于虾过敏往往持续终生，且目前尚无标准化治疗方法，最有效的预防策略仍然是避免摄入或接触含有过敏原的食物（Wang等人，2019年；Zhang等人，2018年）。
已有多种传统的分析技术用于检测虾中的TM，包括酶联免疫吸附测定法（ELISA）（Zhao等人，2022年）、聚合酶链反应（PCR）（Radomirovic等人，2023年）、高效液相色谱（HPLC）和质谱（MS）（Wu等人，2024年）。ELISA通过测量颜色强度来定性和定量检测食品过敏原（Lin等人，2024年）；PCR扩增与过敏原相关的特定DNA序列，从而实现其精确识别和验证（Linacero等人，2020年）；液相色谱-质谱（LC-MS）通过检测特定氨基酸序列，在复杂基质中实现对多种过敏原蛋白的高灵敏度和选择性分析，以实现精确的过敏原鉴定（Li等人，2025年）。然而，这些方法依赖于精密仪器、复杂的样品制备程序和专业操作技术，难以满足快速便捷的现场检测需求。因此，侧向流动免疫测定法（LFIA）因操作简便、检测快速和成本低廉而在食品过敏原检测领域显示出广阔的应用前景。普鲁士蓝纳米颗粒（PBNPs）因其优异的生物相容性和独特性质（如低成本、高表面积与体积比以及易于合成和表面修饰）而受到广泛关注。研究表明，与金纳米颗粒相比，PBNPs作为标签时表现出更高的灵敏度（Li等人，2024年）。
目前，食品过敏原检测主要依赖于从天然来源提取的过敏原蛋白（Li等人，2022年）。然而，与来源或提取方法相关的内在问题使得无法保证过敏原提取的质量，例如操作繁琐、成本高昂以及原料中重金属和有毒物质含量过高（Ge等人，2024年）。这些因素阻碍了过敏原提取的标准化，从而影响了测试结果的一致性和可靠性（Chen等人，2024年）。重组技术通过基因工程将编码目标蛋白的核酸序列引入特定宿主细胞，实现大规模蛋白质表达（Han等人，2022年）。与天然提取相比，重组蛋白表达技术可以生产高纯度和高度稳定的重组过敏原，减少其他过敏原的污染可能性，为食品过敏原检测提供更可靠的抗原来源（Xie等人，2024年）。
在本研究中，使用大肠杆菌原核表达系统成功合成了重组原肌球蛋白（rTM），并与其天然形式（nTM）进行了结构和致敏性比较分析。基于这些发现，我们开发了一种基于LFIA技术的、高度灵敏和准确的TM检测方法，该方法利用PBNPs进行单克隆抗体（mAb）标记。所提出的LFIA方法不仅显示出在食品产品中快速灵敏检测TM的巨大潜力，还为进一步研究TM替代品提供了可靠的平台。此外，它有助于优化食品过敏原检测系统，对确保过敏敏感人群的安全具有重要意义。
材料
Ni-NTA Sepharose 6FF由Sangon Biotech有限公司（中国上海）提供。大肠杆菌 BL21 (DE3)感受态细胞购自Qingke Biotechnology有限公司（中国北京）。六氰合铁(III)酸钾（K3[Fe (CN)6]·3H2O）、咪唑和羊抗小鼠IgG由Aladdin Biochemical有限公司（中国上海）提供。用于检测小鼠免疫球蛋白（IgE、IgG、IgG1、IgG2a）、组胺、MMCP-1、IL-4、IL-13和IFN-γ的ELISA试剂盒由Tongwei Biotechnology有限公司提供。
rTM的表达与纯化
对TM基因的序列分析显示，该基因缺乏跨膜区域和信号肽，具有中等程度的疏水性（图1A）。经过密码子优化后，考虑到GC含量和酶切割位点等因素，TM基因被修改为总长度855 bp，编码284个氨基酸。该基因的氨基酸一致性为75.09%，GC含量从58%降低到50%（图1B）。随后将TM基因插入pET-28a载体中进行表达。
结论
本研究成功使用大肠杆菌表达系统表达了rTM，并对其结构进行了分析。结构分析表明，rTM与nTM具有高度的结构相似性。在BALB/c小鼠模型中，两种蛋白质均显著提高了血清中的特异性IgE、组胺和MMCP-1水平，其中rTM的致敏性可与nTM相媲美。它们还诱导了类似的Th2主导的免疫反应，表现为IL-4和IL-13水平升高以及IFN-γ水平降低。
CRediT作者贡献声明
余春迪：撰写 – 审稿与编辑。张颖：撰写 – 初稿。马泽坤：方法学研究。艾什法克·艾哈迈德：撰写 – 审稿与编辑。徐天蛟：验证。杨青丽：数据管理。吕良涛：资金筹集。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。
致谢
国家自然科学基金（32302237），山东省自然科学基金（ZR2022QC125），山东省高校青年创新团队计划（2024KJH125）以及青岛农业大学高层次人才启动基金的支持。
