《Food Research International》：A metabolomics approach to fingerprint the heat-induced alterations in milk and identify potential thermal biomarkers
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热加工代谢指纹及生物标志物研究。通过非靶向代谢组学分析15种温度-时间处理牛奶的代谢变化，检测到2277种代谢物，揭示美拉德反应产物和脂质氧化通路显著扰动，5329个差异代谢物中135℃组与生奶差异最大。乳糖下调，脯氨酸、腺苷、肉碱等上调，为热加工品质评估提供新生物标志物。
阿希库尔·拉赫曼（Ashikur Rahman）|宁莉（Ning Li）|陈美青（Meiqing Chen）|萨努西·沙姆苏丁·纳萨拉瓦（Sanusi Shamsudeen Nassarawa）|赵晓伟（Xiaowei Zhao）|赵胜国（Shengguo Zhao）|郑楠（Nan Zheng）|张杨东（Yangdong Zhang）|王佳琪（Jiaqi Wang）
中国农业科学院动物科学研究所，农业部牛奶与乳制品质量安全控制重点实验室，北京 100193，中国
摘要
本研究采用非靶向代谢组学方法，分析了在15种温度-时间处理（63–136°C）下牛奶的热诱导代谢变化。从经过热处理的牛奶样本中检测到2277种代谢物，包括有机酸、苯类化合物、杂环化合物、醛类、酮类、酯类、氨基酸、碳水化合物、醇类、胺类、脂肪酸、脂质及其衍生物，涵盖了15个处理组。多变量分析（PCA、HCA）和KEGG通路富集结果显示，热处理导致了代谢紊乱，尤其是在美拉德反应产物和脂质氧化通路中。共观察到5329种差异表达的代谢物，其中135°C处理组与原始牛奶组之间的变化最为显著。与氨基酸和碳水化合物代谢相关的通路显著富集。乳果糖的表达量持续下降，而L-脯氨酸、腺苷和肉碱的表达量上升，这表明它们可能是热处理的潜在生物标志物。这些发现揭示了牛奶的热诱导生化变化，以及乳果糖作为牛奶质量和 authenticity 的潜在生物标志物的潜力。需要进一步研究以评估该生物标志物的实际可行性，并优化乳制品加工技术。
引言
代谢组学是一种用于表征低分子量化合物的先进技术。研究牛奶代谢组最常用的技术包括GC–MS、LC-MS和NMR光谱（Rocchetti & O'Callaghan, 2021）。多变量统计工具如PCA、PLS-DA和OPLS-DA对于分析和解释代谢组学数据至关重要。牛奶代谢物可用作生物标志物，用于预测牛群健康状况（Xu, Van Knegsel等, 2020）、技术功能特性（Gauglitz等, 2020）、验证牛奶真实性（Tomassini等, 2019; Wang等, 2025; Yang等, 2016）以及乳制品（Wu等, 2025）。该技术还可以用于区分牛奶来源、验证养殖方式、检测加工差异以及识别原产地保护标志（Suh, 2022; Rocchetti & O'Callaghan, 2021）。靶向方法仅限于识别和定量已知代谢物，而非靶向方法则将实验组与对照组进行比较，从而阐明两者之间的关系，并能检测样本中的代谢物并提供定量信息，以找出组间具有统计学显著差异的代谢物（Gauglitz等, 2020; Wang等, 2025）。
牛奶富含营养成分，但经过热处理后其营养成分和结构会发生变化（Fox等, 2015）。巴氏杀菌和超高温处理（UHT）是乳制品行业中应用最广泛的两种热处理方法（Deeth, 2022b）。牛奶的营养价值与其代谢组密切相关（Posma等, 2020），因此热处理引起的代谢变化对牛奶营养至关重要。热处理虽然保护了牛奶的安全性，但也引发了复杂的代谢变化，但这些变化尚未得到充分研究。此前，我们的实验室开发了一种代谢组学工作流程，利用超高效液相色谱与四极杆飞行时间质谱联用技术及多变量分析方法，研究了热处理对牛奶成分和代谢物的影响（Zhang等, 2018）。然而，之前的实验仅比较了原始牛奶与在85°C下加热15秒（巴氏杀菌）或在135°C下加热15秒（UHT）后的牛奶，缺乏对中间温度的处理评估。以往的代谢组学研究主要集中在巴氏杀菌和UHT上。本次研究将样本分为15个处理组，基于63°C至136°C的温度和时间组合范围，以探索并建立系统的、全面的代谢梯度研究。在本研究中，牛奶在14种不同的温度-时间组合下进行加热，以全面分析代谢变化。热处理导致牛奶蛋白质变性，有助于测量热处理强度并识别热生物标志物。如果牛奶在80°C下加热15秒，β-乳球蛋白（BLG）会发生显著变性（Chen等, 2005）。使用ELISA方法检测α-乳白蛋白（ALA）的变性指数，可以补充BLG的数据，用于评估热负荷（Dupont等, 2004）。基于多重反应监测（MRM）的液相色谱-质谱技术可以量化晚期美拉德反应产物（如呋喃糖、N-ε-(羧甲基)赖氨酸（CML）、赖氨酰丙氨酸（LAL）、N-ε-(羧乙基)赖氨酸（CEL）和半胱氨酸（LAN）的浓度，这些产物可作为热处理的生物标志物（Aguilera-Toro等, 2022; Erbersdobler & Somoza, 2007）。Li等（2021）报告了巴氏杀菌和灭菌处理后牛奶中呋喃糖、呋喃醛、AGEs（CML和CEL）浓度的变化以及前体物质（赖氨酸和乳糖）的减少。Marconi等（2004）指出乳果糖能有效区分高温处理的牛奶，并提出了UHT质量控制的参考水平（约600 mg/L）。Ayala等（2017）尝试基于前端荧光建立乳果糖浓度的预测模型。UPLC-QTOF研究区分了原始牛奶、巴氏杀菌牛奶和UHT牛奶，并展示了通路级别的热变化特征（Zhang等, 2018）。大多数先前的代谢组学研究主要集中在巴氏杀菌和UHT终点。然而，现有方法在明确区分不同温度下加热的牛奶方面存在局限性，未能提出有效的区分指标。本研究旨在通过识别差异代谢物和紊乱的代谢通路，评估代谢组学数据的稳定性和重复性，并通过非靶向代谢组学方法提出牛奶质量和真实性评估的潜在生物标志物。本研究采用基于LC-MS的全面工作流程，分析了热处理牛奶样本中的极性和非极性代谢物，随后通过多变量分析（PCA和PLS-DA）研究了代谢组成，从而识别关键生化标志物，更深入地了解了热处理引起的代谢变化。
样本采集
原始荷斯坦奶牛的牛奶来自中国上海的一家奶牛场，运输过程中保持4°C，并在24小时内进行处理。热处理使用的是APV多功能灭菌器试点系统（SPX FLOW, 上海），该系统配备了间接板模块、间接管状模块、直接蒸汽注入室、真空旋风分离器和均质器。该试点设备的处理能力约为200–300 L/h。牛奶样本是随机选取的。
代谢物鉴定概述
共检测到2277种代谢物，其中1291种在正离子化条件下被鉴定，986种在负离子化条件下被鉴定（S1B）。二次筛选确认了1976种代谢物，增强了数据集的广度和可靠性，其中正离子化条件下有1092种，负离子化条件下有884种。在10个实验组中，有5329种代谢物表现出统计学上的显著变化，包括2554种上调和2775种下调（表1）。
代谢途径的整体变化分析
基于途径的代谢变化分析方法——差异丰度得分（DA Score）——能够捕捉整个途径内所有代谢物的整体变化。根据P值从低到高的排序，选择了前20个途径（图6e）。差异丰度得分（DA Score）显示了整体途径的失调情况（图6e），其中脂质代谢显著下调。本研究分析了15组热处理牛奶的代谢谱型。
结论
代谢组学与多变量分析的结合应用可以表征牛奶的热特征。135°C是热处理过程中营养损失的关键温度点，尽管基本的生化变化在100°C以上就开始发生。不同处理组之间的某些代谢途径存在差异。我们的结果提供了详细的代谢组学特征，有助于探讨热处理对牛奶的影响。
阿希库尔·拉赫曼（Ashikur Rahman）：撰写——初稿、方法论、数据管理、概念构思。
宁莉（Ning Li）：撰写——审阅与编辑、实验研究。
陈美青（Meiqing Chen）：数据管理。
萨努西·沙姆苏丁·纳萨拉瓦（Sanusi Shamsudeen Nassarawa）：撰写——审阅与编辑、软件使用。
赵晓伟（Xiaowei Zhao）：撰写——审阅与编辑。
赵胜国（Shengguo Zhao）：监督、软件使用。
郑楠（Nan Zheng）：监督。
张杨东（Yangdong Zhang）：撰写——审阅与编辑、方法论、概念构思。
王佳琪（Jiaqi Wang）：项目管理、资金筹集。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
本研究得到了国家重点研发计划（2022YFD1301004）、农业科技创新计划（ASTIP-IAS12）以及CARS专项基金（CARS-36）的财政支持。
