《Food Research International》：l-Lysine effects on myosin carbonylation in metal-catalyzed oxidation: Implications for thermal gelation
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本研究探究了α-氨基 adipic semialdehyde（AAS）介导的赖氨酸羰基化对猪肌动蛋白热凝胶化的影响。通过金属催化氧化系统处理并添加不同浓度L-赖氨酸，发现氧化显著增加肌动蛋白羰基化，破坏其α螺旋和三级结构，导致凝胶持水能力和弹性模量下降。而外源L-赖氨酸的添加有效抑制AAS形成，缓解氧化损伤，维持凝胶功能。
刘玉玲|吴玉琪|韩格|何佳欣|王亚文|潘金凤|李胜杰
大连工业大学食品科学与技术学院，中国辽宁省大连市甘井子区116304
摘要
本研究探讨了α-氨基己二醛（AAS）介导的赖氨酸羰基化对猪肌球蛋白热凝胶化的影响。纯化的肌球蛋白（2 mg/mL）先用N-乙基马来酰亚胺处理以阻断巯基，然后在金属催化的氧化体系（10 μM FeCl?、100 μM抗坏血酸和5 mM H?O?）中，在不同浓度的L-赖氨酸（0–60 μM）下，在4°C下氧化24小时。系统地监测了肌球蛋白的理化性质、结构构象和流变特性（G’）。经过热诱导凝胶化（20–80°C）后，评估了所得凝胶的持水能力（WHC）、微观结构和分子间力。结果表明，氧化显著诱导了肌球蛋白的羰基化，表现为总羰基和AAS含量的显著增加。这种氧化应激导致蛋白质溶解度下降、浊度增加和颗粒尺寸增大，以及α-螺旋和三级结构的破坏。因此，所得凝胶的WHC和G’显著降低，其微观结构更加多孔和无序。相反，添加L-赖氨酸以剂量依赖的方式有效抑制了AAS的形成，从而减轻了肌球蛋白理化和结构性质的氧化损伤，并保持了其凝胶化功能。这些结果表明，AAS介导的赖氨酸羰基化对肌球蛋白的结构完整性和凝胶化性能具有不利影响。此外，外源性L-赖氨酸的添加为缓解肌肉蛋白系统的氧化劣化提供了一种潜在策略。
引言
肌球蛋白是肌肉中的一种必需蛋白质，在影响猪肉的质地、保水性和营养特性方面起着关键作用，这直接影响肉制品的整体质量（Cao等人，2025年）。肌球蛋白由两条重链和四条轻链组成，是一种典型的纤维蛋白，不溶于水，但可溶于高离子强度的盐溶液中（Chen、Xu等人，2016年；Gao等人，2019年）。在肉类加工过程中，肌原纤维蛋白（尤其是肌球蛋白）起着重要作用，因为加热时肌球蛋白通过蛋白质-蛋白质相互作用形成三维的粘弹性凝胶基质，而肌球蛋白的热凝胶化特性是肉制品风味的关键决定因素，如嫩度、多汁性和口感（Xiong，1997年）等。结构紧密的凝胶能有效固定水分，保证良好的质地和高商业价值，而结构松散的凝胶则会导致水分释放、质地差和经济价值降低（Samejima等人，2016年）。然而，肉类加工和储存过程中活性氧引起的氧化损伤可能导致氨基酸侧链的改变和肌球蛋白的结构变化，进而导致蛋白质过度交联和聚集，形成持水能力低的粗糙网络（Ramadhan等人，2024年）。这些结构退化会导致肉制品宏观质量的下降，表现为质地异常、弹性差和切片性差，以及汁液流失严重（Bao & Ertbjerg，2018年）。
蛋白质羰基化不仅是蛋白质氧化的主要后果和关键指标，而且与肌球蛋白凝胶化性质的下降密切相关，最终影响肉制品的风味（Liu等人，2023年）。在肉类加工和储存过程中，金属催化的氧化反应（也称为Fenton反应）是蛋白质氧化的主要途径，其中过渡金属离子催化过氧化氢生成高活性羟基自由基。这些自由基随后诱导蛋白质羰基化，导致肌原纤维蛋白的功能性质退化（Peng等人，2022年）。然而，肉类加工过程中蛋白质羰基化的具体途径及其对肌球蛋白凝胶化性质的影响机制尚不清楚。这一限制是由于目前用于研究肉类加工过程中蛋白质羰基化的2,4-二硝基苯肼（DNPH）方法只能确定总羰基含量，而不能区分具体的羰基化途径（Bao等人，2025年）。生物样本和肉制品中蛋白质羰基化的主要途径已被确定为碱性氨基酸残基（如赖氨酸、精氨酸和脯氨酸）的氧化脱氨（Akagawa，2021年）。与精氨酸相比，赖氨酸残基具有更多的潜在氧化位点。这种较高的易感性，加上灵活的离子配位和高度反应性的ε-氨基，使赖氨酸成为酶促和化学修饰的主要靶标（Azevedo & Saiardi，2016年）。特别是α-氨基己二醛（AAS）已被证明是一种特征性的蛋白质羰基，它是由赖氨酸残基的氧化脱氨产生的（Akagawa等人，2006年；Estévez等人，2009年；Wang、Jia等人，2023年；Wang、Li等人，2023年）。此外，在构成肌球蛋白分子的4500多个残基中，大约有42个是含有巯基的半胱氨酸，而赖氨酸残基约有201个，为AAS的形成提供了许多潜在位点（Domínguez等人，2021年；Ramamurthy等人，2001年）。因此，可以推测金属催化氧化导致赖氨酸残基转化为AAS可能在影响肌球蛋白凝胶化性质方面起着关键作用。
因此，本研究旨在利用我们最近建立的AAS测定方法（Wang、Jia等人，2023年；Wang、Li等人，2023年）来阐明AAS介导的赖氨酸羰基化与金属催化氧化过程中肌球蛋白凝胶化之间的关系。为此，向肌球蛋白溶液中添加不同浓度的L-赖氨酸（0、20、40、60 μM），以建立不同AAS形成程度的模型。假设外源性L-赖氨酸的存在会竞争性地抑制金属催化氧化过程中肌球蛋白内赖氨酸残基的氧化。
材料
三头体重在70至80公斤之间的雄性杂交猪在本地屠宰场被宰杀，死亡后48小时内收集每头猪最长背肌（每头猪一侧）。然后将肉用装有冰的冷却器运输到实验室，去除可见的脂肪结缔组织。之后，将肉切成小块，每份样品重50克，真空密封后储存
溶液中肌球蛋白的金属催化羰基化
蛋白质羰基化程度被认为是蛋白质氧化的重要标志物，此外还可能影响肌球蛋白的功能性质，如其凝胶特性（Zhao等人，2020年）。蛋白质羰基化可以通过四种不同的途径在生物和食品系统中产生：(i) 基本氨基酸残基（如赖氨酸、精氨酸和脯氨酸）的自由基介导的氧化脱氨；(ii) 二羰基化合物对这些残基的氧化脱氨
结论
本研究系统阐明了α-氨基己二醛（AAS）介导的赖氨酸羰基化调节肌球蛋白凝胶化性质的机制。我们的发现表明，金属催化的氧化显著诱导了蛋白质羰基化，AAS的形成是肌球蛋白变性、α-螺旋和三级结构破坏以及随后异常蛋白质聚集的主要驱动因素。从胶体角度来看，这些结构变化直接
CRediT作者贡献声明
刘玉玲：撰写——原始草稿、可视化、方法学、研究、正式分析、数据管理。吴玉琪：可视化、验证、软件、方法学、研究、正式分析、数据管理。韩格：撰写——审阅与编辑、数据管理。何佳欣：可视化、方法学、概念化。王亚文：可视化、方法学。潘金凤：撰写——审阅与编辑。李胜杰：撰写——审阅与编辑、监督、资金获取、数据管理
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。
致谢
本研究得到了国家自然科学基金（资助编号：32272352 和 U24A20472）的资助。
