莲叶多糖在体外模拟消化和粪便发酵过程中对结合型杂环胺释放以及游离型杂环胺诱导的细胞毒性的双重抑制作用

《Food Research International》：Dual attenuation of bound heterocyclic amine release and free heterocyclic amine-induced cellular toxicity by lotus leaf polysaccharide during in vitro simulated digestion and fecal fermentation

莲叶多糖抑制肉制品中结合杂环胺释放及减轻细胞毒性的机制研究。通过体外消化和粪便发酵模型分析，发现LLP可剂量依赖性抑制不同系统（肉饼、肌原纤维、线粒体蛋白）中结合杂环胺的释放，最高抑制率达37.17%。抑制效果存在模型特异性，同时LLP通过缓解氧化应激和炎症反应减轻游离杂环胺（如PhIP）诱导的细胞损伤，揭示了膳食多糖抑制杂环胺毒性的双重机制。

　　

刘长伟|刘璐|曾宏哲|薛朝阳|李琴宇|邓森文|刘中华|郭世银

湖南科技大学资源与环境安全工程学院，湘潭411201，中国

摘要

本研究利用体外消化和粪便发酵模型，系统探讨了莲叶多糖（LLP）如何抑制牛肉饼、肌原纤维蛋白（MP）和肌浆蛋白（SP）系统中结合型杂环胺（HAs）的释放。同时评估了LLP缓解游离HAs引起的细胞毒性的潜力。体外消化显著促进了HA的释放，其中β-咔啉类HA的释放量最高。LLP以剂量依赖的方式抑制HA的释放，在三种系统中的最大抑制率分别为29.82%、37.17%和30.49%。LLP对不同类型HA的抑制作用具有特异性：在牛肉饼系统中主要抑制吡啶类和咔啉类HA；在肌原纤维蛋白模型中主要抑制吡啶类和喹啉/喹诺酮类HA；在肌浆蛋白模型中则抑制喹啉/喹诺酮类和咔啉类HA。与体外消化相比，粪便发酵过程中HA的释放量较低。LLP也以剂量依赖的方式减少了HA的释放，最大抑制率分别为16.00%、13.67%和20.55%。值得注意的是，在肌浆蛋白模型中仅咔啉类HA受到显著抑制。LLP通过减轻氧化应激和炎症反应，有效缓解了游离PhIP引起的细胞损伤。本研究揭示了LLP的双重作用机制：阻止结合型HA的释放并对抗其相关的氧化/炎症毒性，从而揭示了膳食多糖在消化过程中减轻HA毒性的多靶点作用，为更安全的食品加工提供了功能成分的开发方向。

引言

杂环胺（HAs）含有氮杂环结构，主要在高温肉类加工过程中（如煎炸、烧烤）产生，可分为两类：氨基咪唑杂环胺（AIAs）和氨基咔啉类（ACs）（Dong, Ye, Bai, Zeng, & Wu, 2024）。国际癌症研究机构将IQ归类为2A组致癌物，而MeIQ和PhIP则归类为2B组致癌物（Cheng, Leible, Weiss, & Gibis, 2023）。HAs代谢激活后会形成DNA加合物（如PhIP-DNA加合物），导致碱基错配和突变；流行病学研究表明，长期摄入HAs与结直肠癌和乳腺癌的风险增加显著相关，某些HAs（如Harman）可通过增强其他HAs的致癌活性而产生协同致突变效应（Dong, Xian, Li, Bai, & Zeng, 2020; Edna Hee, Liang, Zhang, & Fang, 2024; Gibis, 2016）。HAs主要通过两种途径生成：（1）美拉德反应途径，肌酸在超过150°C的温度下与氨基酸（如苯丙氨酸）反应，生成吡嗪和吡啶等中间体，进而形成AIAs（如PhIP和IQx）；（2）脂质氧化产生的自由基促进活性羰基化合物的形成，从而促进HAs的生成（Zamora & Hidalgo, 2020）。

结合型HA通过共价或非共价相互作用与蛋白质结合，在消化过程中会转化为游离型HA，从而显著增强毒性（Chen et al., 2024; Chen, He, Qin, Chen, & Zeng, 2017）。目前对结合型HA释放机制的理解主要基于体外消化模型（Shen et al., 2024），但涉及肠道微生物群的关键中介途径仍需进一步研究。体外消化研究表明，大部分结合型HA在胃肠道加工过程中释放，释放的游离型HA具有更高的致癌性（Shen et al., 2024; Xue et al., 2022a）。值得注意的是，β-咔啉类HA（如Harman、Norharman）在肠道中的释放率最高，并通过协同机制增强其他HAs的基因毒性。某些膳食成分可以调节这种释放：香料（黑胡椒）、水果（苹果）和蔬菜（洋葱）可显著促进消化过程中结合型HA向游离型HA的转化（Xue et al., 2022b），而当归多糖则通过体外实验抑制HA的释放（Shen et al., 2024）。

然而，目前对结合型HA释放机制的理解主要基于体外消化模型，涉及肠道微生物群的关键中介途径尚未充分研究。关键的肠道细菌属（如Bacteroides和Lactobacillus）及其代谢酶（如二肽肽酶、内肽酶）对蛋白质特定区域或化学键具有选择性，可将复杂蛋白质分解为寡肽并释放游离氨基酸（Boudry, Le Hu?rou-Luron, & Michel, 2016; Hur, Lay Jr., Beger, Freeman, & Rafii, 2000; Ma, Tian, Wu, & Ma, 2017; Savijoki, Ingmer, & Varmanen, 2006）。这些酶活性表明它们可能在结合型HA的释放中起作用。因此，系统研究微生物对结合型HA释放的调节机制，特别是肠道微生物群的作用，是当前研究的重点。

结合型HA释放为游离型HA会通过多种机制加剧细胞损伤，包括促进氧化应激、加重线粒体功能障碍和诱导DNA损伤（Carvalho et al., 2015; Nicken, Hamscher, Breves, & Steinberg, 2010; Syeda, Foguth, Llewellyn, & Cannon, 2020; Zhang et al., 2023）。尽管消化后游离HAs的健康风险增加，但目前的研究主要集中在减少原始食品中的游离HAs（Kang et al., 2022; Khan et al., 2022; Lai, Lee, Cao, Zhang, & Chen, 2023），而对结合型HA释放的动力学，尤其是在肠道微生物群背景下的研究较少。鉴于其消化引发的毒性放大作用，系统研究结合型HA的释放途径并开发针对性的抑制策略是食品毒理学中的关键需求。因此，迫切需要开发同时抑制HA释放并减轻后续毒性的双重干预策略。

莲叶多糖（LLP）作为莲叶中的重要生物活性成分，近年来因其多方面的生物学功能而受到广泛关注。研究表明，LLP具有抗氧化、抗炎和调节肠道健康等广泛生物学作用（Chen, Zhu, & Guo, 2019; Hu, Gen, Cheng, Xiao-Yi, & Tao, 2024; Ke, Lin, & Zhao, 2023; Wang, Hu, Wang, Yang, & Kuang, 2023b; Zheng et al., 2022）。然而，LLP是否能有效抑制胃肠道加工过程中（由消化酶和肠道微生物群活动引起）结合型HA的释放，并对抗HA引起的细胞损伤，仍有待进一步研究。

在三种模型系统（烤牛肉饼、肌浆蛋白和肌原纤维蛋白）中，评估了LLP对结合型HA释放的剂量依赖性抑制作用（0.05%、0.10%和0.15%）。使用UPLC-MS/MS分析了HA的释放动态。此外，还使用Caco-2细胞评估了多糖对PhIP（最具毒性和研究最广泛的HA）引起的细胞损伤的保护作用，并探讨了其保护机制，包括抑制氧化应激和炎症反应的相关途径。

材料与试剂

Santa Cruz Biotechnology, Inc.提供了HAs标准品。Waters公司提供了MCX固相萃取柱。其他试剂购自Sinopharm有限公司。消化酶来自中国上海的Yuanye Biotechnology有限公司。新鲜牛肉里脊肉样本来自中国长沙的当地市场。

LLP的提取

LLP的提取和纯化方法参考了Song, Han, Lim, Lee和Hong（2019）的方法，并进行了修改。具体步骤为：首先清洗新鲜莲叶...

LLP结构分析

单糖组成分析结果显示（图1A和B），LLP主要由Gal（46.49%）、Ara（21.32%）、Rha（7.82%）和GalA（6.29%）组成，还含有少量的Fuc、Xyl、Man、Glc和GlcA。其中，RG-I结构占83.45%。推测其主链结构为→2)-α-Rhap-(1→4)-α-GalpA-(1→，侧链主要由阿拉伯糖和半乳糖（AG-I和AG-II）组成，表明LLP主要具有RG-I型果胶结构。

方法学结果

色谱分析...

结论

系统分析表明，LLP在抑制HA释放和减轻毒性方面具有双重作用。研究发现，消化显著促进了HA的释放，牛肉饼中的总HA含量从7.05 ng/g增加到95.21 ng/g，其中β-咔啉类HA（如Norharman）的释放量最明显，从3.22 ng/g增加到71.06 ng/g。LLP表现出剂量依赖的抑制作用，在三种系统中的最大抑制率分别为29.82%、37.17%...

作者贡献声明

刘长伟：撰写初稿、资源准备、方法学设计、实验实施、数据分析、概念构建。刘璐：审稿与编辑、方法学设计、实验实施、概念构建。曾宏哲：方法学设计、实验实施、数据分析。薛朝阳：资源准备、方法学设计、实验实施。李琴宇：软件使用、方法学设计、实验实施、数据分析。邓森文：撰写与编辑、软件使用、方法学设计、数据分析。刘中华：

资金来源

本研究部分得到了国家自然科学基金（编号：32502775）、中国博士后科学基金会博士后奖学金计划（C级）（编号：GZC20251959）、中国博士后科学基金会（编号：2025M773733）以及湖南省自然科学基金（编号：2026JJ60023）的支持。国家林业局重点实验室也提供了资助（编号：GZKF202204）。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。