《Food and Waterborne Parasitology》：Validation of an optimized in-house enzyme-linked immunosorbent assay for enhanced detection of
Trichinella spp. exposure in swine
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为提升猪群旋毛虫流行病学监测的准确性，研究人员对基于旋毛虫排泄-分泌抗原的间接ELISA法进行了优化与标准化。与商业化试剂盒对比，优化后内部E-S ELISA在诊断灵敏度和特异性上均达到100%，且展现出更高的解析力与检测灵敏度，结合蛋白免疫印迹确证可实现99.98%的特异性，为猪旋毛虫暴露的血清学筛查提供了更可靠的工具体系。
旋毛虫病是一种由旋毛虫属线虫引起的人畜共患寄生虫病，历史上多数病例与食用受感染的猪肉有关。尽管现代工业化养猪业通过严格的生物安全管理和屠宰后检测已将商业猪群感染风险降至极低水平，但旋毛虫感染仍是影响猪肉国际贸易的重要食品安全与监管问题。为了进行有效的流行病学监测，世界动物卫生组织和国际旋毛虫病委员会推荐使用基于旋毛虫排泄-分泌抗原的间接酶联免疫吸附试验（ELISA）。然而，血清学检测方法的性能，特别是其特异性，直接影响监测结果的可靠性。此前，加拿大食品检验局在一次全国性调查中使用商业化E-S ELISA试剂盒时，遇到了假阳性率意外偏高的问题。这促使研究人员着手优化和标准化其内部E-S ELISA与确证性蛋白免疫印迹（WB）的检测流程，以期获得更准确、可靠的监测工具。
这项研究旨在验证优化后的内部E-S ELISA，并将其诊断性能与经验证的商业化PrioCHECK E-S ELISA试剂盒进行比较，同时也生成了内部WB检测方法的验证数据。研究论文发表在《Food and Waterborne Parasitology》期刊上。
研究人员主要采用了三种关键技术方法：
- 1.
间接E-S ELISA：使用从旋毛虫一期幼虫体外培养获得的排泄-分泌抗原包被反应板，检测猪血清中的特异性抗体。研究比较了优化前后的内部ELISA方案以及商业化试剂盒。
- 2.
蛋白免疫印迹（WB）：作为确证试验，用于判定E-S ELISA阳性结果。通过在膜条上进行电泳分离ESA蛋白，再与血清孵育，观察是否存在分子量约在43-57 kDa范围内的三条紧密相邻的蛋白条带（诊断性三联带）作为阳性判读标准。
- 3.
血清样本队列：研究使用了来自加拿大各地（如魁北克、安大略、曼尼托巴等省份）的商业猪血清（假定为旋毛虫阴性）和实验感染旋毛虫（包括T. spiralis, T. pseudospiralis, T. britovi, T. nativa等物种）的猪血清。其中，用于评估内部ELISA诊断特异性的样本量总计达6344份。
以下是研究的主要结果：
3. 结果
3.1. ELISA方案优化效果显著
通过测试2011年收集的55份假定阴性母猪血清，发现与早期使用抗猪免疫球蛋白G重链和轻链（IgG H+L）二级抗体的ELISA方案相比，优化后的方案（采用更高的血清稀释度及特异性针对IgG Fc片段的二级抗体）显著降低了吸光度值，表明非特异性反应大幅减少。使用IgM特异性抗体的检测则显示较高的吸光度，提示多反应性天然IgM是背景反应的主要贡献者。
3.2. 内部E-S ELISA与商业化试剂盒性能对比
在917份阴性猪血清和88份实验感染阳性血清的测试中，优化后的内部E-S ELISA与PrioCHECK E-S ELISA均表现出100%的诊断灵敏度与特异性，两者一致性达到“几乎完美”（Kappa = 1.00）。内部E-S ELISA展现出更强的区分能力，阳性血清与阴性猪群样本的归一化检测值分离更为明显。此外，内部E-S ELISA的分析灵敏度也更高，对感染T. spiralis、T. pseudospiralis、T. britovi和T. nativa的猪血清进行系列稀释时，能在更高稀释度下仍检测出阳性结果。
3.3. 大规模商业化猪群检测验证特异性
使用内部E-S ELISA继续检测2019-2020年收集的5427份商业化猪血清，结合2018年的917份样本，总计6344份样本中仅有11份检测值高于临界值。其中10份经WB确证为阴性。因此，内部E-S ELISA单独使用时的诊断特异性为99.83%，而与WB联合使用时的特异性高达99.98%。
3.4. 蛋白免疫印迹（WB）在早期检测中的优势
在对15头实验感染不同低剂量T. spiralis的仔猪进行系列血清检测时，WB在5头猪中比优化的E-S ELISA更早检测到血清转化，表明WB在某些情况下具有更高的早期检测灵敏度。
3.5. 蛋白免疫印迹（WB）的特异性评估
在307份内部E-S ELISA检测为阴性的血清中，仅有3份（0.98%）在WB中出现了与阳性对照相似的诊断性三联带模式，但强度较低或伴随条带模式存在差异，进一步证实了WB作为确证试验的高特异性。
4. 讨论与结论
本研究的讨论部分总结了优化后内部E-S ELISA及确证性WB的稳健诊断性能。研究证实，优化内部E-S ELISA性能的关键改进包括：使用针对IgG Fc片段的二级抗体以减少多反应性IgM的干扰、在血清稀释液中添加脱脂奶粉和牛血清白蛋白以阻断非特异性相互作用、以及采用更高的检测血清稀释度。这些优化在显著降低背景反应的同时，并未损害检测灵敏度，反而使其分析灵敏度高于商业化试剂盒。
研究结果支持将优化后的E-S ELISA与确证性WB联合用于猪群旋毛虫暴露的流行病学调查。这种方法组合对于监测风险较高的猪群（如有机养殖或户外放养）尤其有价值，因为在这些生产方式中，猪接触携带旋毛虫的野生动物的风险更高。血清学监测比作为食品安全金标准的人工消化法检测肌肉幼虫更敏感，能够发现那些感染水平低、幼虫无法被人工消化法检出的暴露事件。
然而，研究也指出了局限性，例如将商业化猪群假定为“无旋毛虫”群体而未用金标准方法逐个验证，以及阳性样本主要来自实验感染动物，缺乏自然感染样本。此外，即使WB是血清学金标准，针对ESA中免疫优势碳水化合物表位（含β-tyvelose）的抗体仍存在与其他微生物发生交叉反应的可能性。因此，在监测无旋毛虫猪群时，血清学阳性预测值较低，任何经E-S ELISA筛查和WB确证的阳性结果都需要进行流行病学追踪调查。
总之，这项研究验证了一套高灵敏度、高特异性的内部E-S ELISA与WB血清学检测体系。该体系为评估猪群旋毛虫暴露风险、支持猪肉行业生物安全监测以及为相关国际贸易提供科学数据，提供了可靠的技术工具。
