《Food Research International》：Quantifying infectious murine norovirus 1 in heat-processed seaweed
编辑推荐：
诺如病毒（HuNoV）是导致全球急性胃肠炎的主要病原体，传统RT-qPCR无法区分活病毒与失活病毒。本研究以鼠诺如病毒1（MNV-1）为模型，通过热稳定性筛查发现RdRp基因区4289-4586nt为热敏感位点，结合表面活性剂增强的PMAxx预处理和长片段RT-qPCR技术，开发出能同步检测病毒衣壳完整性和基因组损伤的检测方法，在含海藻的复杂基质中检测限达0.31 log TCID50/5g，并验证其在85℃以上高温下准确量化病毒失活。
高世珏|李慧|邓清伟|格洛丽亚·桑切斯|马学军|姚红|吴希阳
中国广州济南大学食品科学与工程系，邮编510632
摘要
人类诺如病毒（HuNoV）是全球非细菌性胃肠炎的主要致病因子。尽管RT-qPCR是检测HuNoV的金标准方法，但它无法区分具有传染性的病毒颗粒和无传染性的病毒颗粒。为了克服这一局限性，本研究使用小鼠诺如病毒1型（MNV-1）作为替代病毒，开发了一种病毒完整性检测方法。通过比较稳定性筛选，确定RNA依赖性RNA聚合酶区域中的核苷酸4289–4586为特定的热不稳定基序。通过设计一个包含该区域的425个核苷酸的qPCR扩增子，并结合表面活性剂辅助的PMAxx预处理技术，该检测方法能够同时评估病毒衣壳的完整性和基因组损伤，在海藻基质中的检测限为0.31 log TCID50/5?g。针对细胞培养的验证证实，该方法能够准确量化高温（> 85?°C）下的病毒灭活情况。所提出的完整性检测方法（PMAxx-PMA增强剂-长距离RT-qPCR）为评估复杂食品基质中的病毒灭活情况提供了可靠的框架，并为那些不适合使用培养基方法进行常规筛查的情况提供了一种监测传染性HuNoV风险的潜在策略。
引言
人类诺如病毒（HuNoV）是全球急性胃肠炎的主要原因，约占所有病例的20%，每年导致发展中国家约110万例住院病例和7万人死亡（Saleem等人，2025年）。虽然历史上诺如病毒爆发与贝类（Zhu等人，2025年）、绿叶蔬菜（Yang & Scharff，2024年）和浆果（Saupe等人，2021年）有关，但即食海藻产品最近也被发现是HuNoV的重要传播媒介。全球已有多起海藻产品被诺如病毒污染的事件报告，包括绿藻（Enteromorpha属）、紫菜制品（Sakon等人，2018年）和Goma Wakame沙拉（Raymond等人，2025年），这些事件导致了大量的产品召回和经济损失。海藻多孔且复杂的多糖结构可能有利于病毒包被和存活，特别是对于这些经过最小程度加工的即食产品而言（Raymond等人，2025年），其全球消费量正在增加。准确评估受污染食品、水或环境样本的致病潜力依赖于病毒颗粒的传染性（Wu等人，2022年）。鉴于HuNoV的传染剂量很低（< 100个病毒颗粒）（Asanaka等人，2005年）以及其基因组在复杂基质中的高持久性（Kennedy等人，2023年），因此需要可靠且灵敏的方法来量化传染性HuNoV，以便进行准确的风险评估和有效的公共卫生干预。
尽管最近的一些突破，如人类肠道类器官（HIEs）和斑马鱼幼体模型（Cheng等人，2024年；Van Dycke等人，2019年）使得HuNoV的培养成为可能，但这些系统在技术上要求较高、成本较高且劳动密集，限制了其常规应用。因此，RT-qPCR仍然是食品中常规筛查HuNoV的金标准（ISO，2017年）。然而，标准的RT-qPCR检测方法通常针对的是较短的基因组片段（< 200个核苷酸），仅占整个病毒基因组的不到2%（Simonet & Gantzer，2010年）。这种有限的覆盖范围往往无法区分具有传染性的病毒和失活的病毒，并显著低估了病毒的灭活程度（Rockey等人，2020年）。为了弥补这一不足，提出了长距离RT-qPCR方法，基于较长扩增子更可能包含抑制扩增的灭活诱导损伤这一前提（Rockey等人，2020年；Simonet & Gantzer，2006年；Wolf等人，2009年）。然而，新的证据表明，特定基因组区域的敏感性，而不仅仅是扩增子长度，可能是导致信号丢失与病毒灭活之间的决定性因素（Jiang等人，2019年；Jin等人，2012年）。
为了区分具有完整衣壳的传染性病毒颗粒和具有衣壳损伤的失活病毒颗粒，已经开发了几种衣壳完整性检测方法。基于受体-配体相互作用的策略，包括人类血型抗原（HBGAs）（Hutson等人，2002年；Lyu等人，2024年；Wang等人，2014年）和牡蛎热休克蛋白70（oHSP70）（Sun等人，2026年；Zhang等人，2021年），或酶处理方法（蛋白酶K-RNase暴露检测）（Escudero-Abarca等人，2014年），虽然有一定的实用性，但受到菌株特异性结合效率的限制（Park等人，2008年）或无法检测到轻微的衣壳缺陷（Nuanualsuwan & Cliver，2002年）。目前，基于活菌染料的检测方法也被广泛使用。例如丙啶单氮化物（PMA）及其增强型变体PMAxx可以选择性穿透衣壳受损的病毒颗粒，并在光激活后与病毒核酸共价结合以抑制扩增，而未结合的游离染料在水溶液中会发生光解（Hong等人，2021年；Rachmadi等人，2024年；Randazzo等人，2016年；Veugen等人，2024年）。其他基于金属的染料，如氯铂（IV）（PtCl4），也通过类似机制来区分病毒的传染性（Canh等人，2022年；Cuevas-Ferrando等人，2021年）。尽管这些方法很受欢迎，但其效率可能会受到基质干扰的影响，或者无法检测到由于内部基因组损伤导致的衣壳结构完整性的病毒失活。
温度是影响病毒存活的关键因素，因此热处理成为食品工业中广泛采用的病原体控制技术。为了研究HuNoV的稳定性和灭活动力学，小鼠诺如病毒1型（MNV-1）被广泛用作替代病毒，因为它在形态和基因上与HuNoV相似，并且便于进行体外感染性评估（Cromeans等人，2014年；Fraisse等人，2018年；Li等人，2011年）。在本研究中，使用MNV-1作为HuNoV的替代病毒，开发了一种用于量化热处理海藻中潜在传染性病毒的完整性检测方法。与现有的仅能检测基因组完整性或衣壳完整性的方法不同，本研究通过引入基于机制的设计，超越了简单的PMAxx和扩增组合。利用MNV-1系统地筛选病毒基因组，确定了最易受热降解的特定热不稳定区域。通过针对这一热敏感基序进行长距离扩增，并结合优化的基于表面活性剂的PMAxx预处理技术，开发了一种能够同时捕捉基因组和衣壳损伤的完整性检测方法，有效弥合了分子信号与实际生物感染性之间的差距。
部分内容摘录
病毒株和细胞系
MNV-1和柯萨奇病毒A16（CVA16）的病毒株由中国广州的广东省疾病预防控制中心提供。这些病毒株分别在RAW 264.7细胞和人类横纹肌肉瘤（RD）细胞中繁殖和检测。病毒液是通过感染细胞经过三次冻融循环后，以3000?rpm离心30?分钟去除细胞碎片制备的。传染性病毒的滴度通过50%组织培养传染剂量（TCID50）来测定
结果
如图1A所示，TEM图像展示了MNV-1衣壳在不同热处理30?分钟后的结构特征。在天然状态下，MNV-1颗粒具有完整的衣壳，呈小球形。当暴露在55?°C时，颗粒开始聚集，由于染料穿透部分破裂的衣壳，其内部结构变得清晰可见。在75?°C时，衣壳结构出现...
讨论
本研究采用了31个标准化的扩增子衰减率常数来评估MNV-1中的热诱导基因组损伤。结果显示MNV-1基因组中的降解速率存在显著差异。值得注意的是，5’UTR和ORF1的末端区域对热应力表现出较高的敏感性，特别是在编码RdRp区域的内部片段（4289–4586?nt）中，该区域似乎是热降解的优先靶标。
结论
总之，本研究开发了一种名为PMAxx-PMA增强剂-长距离RT-qPCR的完整性检测方法，作为一种有前景的工具，用于在复杂的热处理海藻基质中选择性地量化传染性诺如病毒。该方法解决了标准RT-qPCR的关键缺陷，即无法区分具有传染性的病毒颗粒和无传染性的病毒颗粒，这对于准确的风险评估是一个重大挑战，因为培养HuNoV非常困难。我们的研究结果表明...
CRediT作者贡献声明
高世珏：撰写——原始草稿、可视化、验证、方法学、实验设计、数据分析。李慧：验证、实验设计。邓清伟：验证。格洛丽亚·桑切斯：撰写——审稿与编辑。马学军：验证。姚红：撰写——审稿与编辑、监督、项目管理、方法学、资金获取、概念构思。吴希阳：撰写——审稿与编辑、监督、项目管理、方法学、资金获取、概念构思。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
本工作得到了
广东省国际科技合作项目（2023A0505050160）、
国家自然科学基金（32502212）和
广州市科技项目（2025A04J3352）的支持。IATA被认证为卓越中心Severo Ochoa CEX2021-001189-S，该项目由MCIU/AEI资助（
10.13039/501100011033）。
