《Food Research International》：Enzymatic modification of pumpkin and groundnut seed proteins for enhanced digestibility: BCAA-enriched peptide profiling and structural-functional characterization
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植物蛋白水解工艺优化及其功能特性研究。通过碱性蛋白酶和热解酶的协同水解，显著提升南瓜和花生种子蛋白的消化率（IVPD从78.53%增至94.57%），生成富含支链氨基酸（Leucine, Isoleucine, Valine）的短链多肽（8-25个氨基酸），同时改善泡沫容量、乳化性和溶解性。结构分析显示蛋白质二级结构变化（α-螺旋减少，β-折叠增加）及微纳结构重构。该工艺为老年人群和蛋白质缺乏群体开发功能性食品提供新途径。
莫妮卡·拉尼（Monika Rani）|格纳内什·库马尔（Gnanesh Kumar）|A. 乔蒂·拉克希米（A. Jyothi Lakshmi）
印度卡纳塔克邦迈索尔市，CSIR-中央食品技术研究所（CSIR-Central Food Technological Research Institute），传统食品与应用营养系（Department of Traditional Foods and Applied Nutrition），邮编570020
摘要
随着对可持续植物性蛋白质来源需求的增加，像南瓜籽和花生籽这样的油籽因其蛋白质含量而受到关注。然而，这些油籽的低消化率和紧密的结构限制了其吸收和生物利用度，尤其是对于消化效率下降的老年人群体。本研究探讨了使用碱性蛋白酶（alcalase）和热蛋白酶（thermolysin）进行顺序蛋白水解对蛋白质消化率、肽谱以及水解产物的结构-功能特性的影响。通过依次使用这两种酶，可以利用它们的互补特性来生成富含支链氨基酸（BCAA）的肽。富含BCAA（亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸）的蛋白质对肌肉蛋白质合成和维持肌肉质量至关重要。水解后，PSI的蛋白质消化率从78.53%提高到94.57%，GSH的蛋白质消化率从75.36%提高到90.16%。SDS-PAGE实验证实了大分子量蛋白质分解为肽。PSH和GSH中出现了低于10 kDa的肽，表明存在多种寡肽。利用LC-MS/MS分析对PSH和GSH进行蛋白质组学表征，揭示了南瓜籽和花生籽中的主要蛋白质成分。PSH中的大多数蛋白质属于11S球蛋白家族，包括β-亚基和类似β的亚基以及种子储存蛋白2类异构体。而在GSH中，最丰富的蛋白质是杯状蛋白（cupin-type storage proteins）和过敏原蛋白（如Ara h 1）。多种肽的鉴定置信度在70%到99%之间。PSH和GSH中的水解产物都含有大量的BCAA肽。这些BCAA残基要么是肽的核心部分，要么位于肽的末端，对它们的生物利用度和生理功能具有重要意义。PSH主要含有8到18个氨基酸的短至中等链长的肽，而GSH则表现出更广泛的肽多样性，包括长度达20-25个氨基酸的肽。这种肽的大小分布表明酶解过程有效，有利于肠道吸收，从而提高了消化率和生物利用度。FTIR和CD光谱分析显示α-螺旋结构减少，β-折叠结构增加，表明蛋白质发生了展开。扫描电子显微镜（SEM）观察到了微观结构变化，X射线衍射（XRD）显示形成了半结晶肽聚集体。水解显著改善了蛋白质的功能特性，如溶解度、起泡能力和乳化性能。这些发现证明了双酶处理在提升种子蛋白质的营养价值方面的有效性，有助于开发功能性食品，特别是针对老年人或蛋白质缺乏的人群。
引言
蛋白质是人类饮食中的重要组成部分，已成为越来越受欢迎的关键营养素，对消费者健康有积极影响。由于植物性蛋白质来源的丰富性、可持续性和营养价值，人们逐渐从动物性蛋白质转向植物性蛋白质。这些因素推动了植物性蛋白质的普及，这一趋势预计将在未来几十年内持续（Langyan等人，2022年）。虽然谷物和豆类长期以来一直是主要的蛋白质来源，但它们的蛋白质含量有限且缺乏某些必需氨基酸。蛋白质缺乏和生活方式相关疾病的高发促使人们寻找更优质的植物性蛋白质来源。
近年来，尤其是南瓜（Cucurbita属）和花生（Arachis属）等油籽因高蛋白质含量（通常为37%至45%，是谷物和豆类的2到4倍）以及高营养价值和丰富的生物活性成分而受到关注。南瓜籽和花生籽主要用于榨油，副产品油饼中含有50-60%的蛋白质（Bu?ko等人，2018年）。南瓜籽蛋白质主要是储存蛋白，其中11S球蛋白（如cucurbitins）和2S白蛋白（Bu?ko等人，2016年）占主导。花生籽蛋白质则主要含有arachin（11S球蛋白）和conarachin（7S球蛋白）。这些富含球蛋白的特性使其具有较高的营养价值。然而，由于消化率低、某些必需氨基酸缺乏以及蛋白质结构紧密，植物性蛋白质的充分利用受到限制（Herztler等人，2020年）。对于消化效率下降的老年人来说，这一问题尤为突出，因为消化酶的活性降低会导致蛋白质消化和氨基酸生物利用度受损（Hinssen等人，2024年）。
越来越多的临床证据表明，尤其是老年人，摄入高于当前推荐水平的蛋白质具有健康益处，包括增加瘦体重（Hudson等人，2020年；Oikawa等人，2019年；Park等人，2018年）、改善运动能力（Mitchell等人，2017年）或步态速度（Park等人，2018年）以及增强骨密度（Rapuri等人，2003年）。富含BCAA的蛋白质对肌肉蛋白质合成和维持肌肉质量至关重要（kamie等人，2020年）。
为了解决这一问题，通过酶处理进行蛋白质水解成为一种有前景的策略，可以分解复杂的蛋白质结构，使其更易于吸收并生成生物活性肽。此外，酶水解有助于弥补胃酶活性的不足，特别是对于消化功能受损的人群。具有BCAA特异性的蛋白酶可以帮助靶向释放富含BCAA的肽。近年来，将酶水解应用于南瓜籽和花生籽蛋白质引起了关注，因为这种方法可以生产出具有增强生物功能特性的高质量蛋白质水解产物（Bucko等人，2018年；Rong等人，2025年；Pacheco等人，2025年）。
本研究旨在探讨使用碱性蛋白酶和热蛋白酶进行顺序酶处理对南瓜籽和花生籽蛋白质水解的影响，研究其对蛋白质消化率、BCAA富集肽的生成、蛋白质结构及功能特性的影响。通过这项研究，我们希望为优化南瓜籽和花生籽蛋白质水解产物的应用提供有价值的见解，特别是在功能性食品、营养保健品和其他促进健康的产品中，特别是针对消化能力受损的人群。
材料
南瓜籽（Cucurbita moschata）和花生籽（Arachis hypogea）从迈索尔当地的市场购买。猪胃黏膜提取的胃蛋白酶（800-2500单位/毫克蛋白质）、猪胰腺提取的胰酶（符合USP标准8倍规格）、来自Geobacillus stearothermophilus的热蛋白酶（30-175单位/毫克蛋白质）均从Sigma-Aldrich Chemicals公司采购。碱性蛋白酶（580单位/毫克）则从荷兰Genencor公司购买。其他所有化学品和标准品也均从Sigma-Aldrich Chemicals公司购买。
结果与讨论
成功从脱脂的南瓜籽和花生籽中分离出了蛋白质。南瓜籽蛋白提取物（PSI）和花生籽蛋白提取物（GSI）的产率分别约为24%和32%。两步提取过程提高了总体产率，可能是由于蛋白质的溶解度提高。分离出的蛋白质可作为后续酶水解和表征的基础材料。
结论
总之，使用碱性蛋白酶和热蛋白酶对南瓜籽和花生籽蛋白质进行顺序水解后，消化率得到改善，产生了富含支链氨基酸的短肽。SDS-PAGE实验证实了大分子量蛋白质的分解和肽的生成，结构变化表明蛋白质发生了展开，消化率也得到了提高。蛋白质鉴定和肽谱分析相结合，提供了对南瓜籽蛋白质生物活性潜力的全面理解。
作者贡献声明
莫妮卡·拉尼（Monika Rani）：撰写初稿、验证、方法设计、实验实施、数据分析、概念构建。
格纳内什·库马尔（Gnanesh Kumar）：审稿与编辑、监督、数据管理。
A. 乔蒂·拉克希米（A. Jyothi Lakshmi）：审稿与编辑、监督、概念构建。
未引用参考文献
Hertzler, Lieblein-Boff, Weiler和Allgeier, 2020
Islam等人，2022
Karama?, Kosińska-Cagnazzo和Kulczyk, 2016
Lamsal, Jung和Johnson, 2007
Nagaoka等人，1999
Vinayashree和Vasu, 2021
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
