重新审视麦角硫因的氧化还原电位：通过光谱法和电化学方法进行测定

《Free Radical Biology and Medicine》：The Redox Potential of Ergothioneine Revisited: Determination by Spectroscopic and Electrochemical Methods

本研究通过光谱学和循环伏安法重新测定了褪黑素（EGT）在生理pH条件下的还原电位，发现其氧化电位为0.45±0.02 V（vs NHE），纠正了之前错误的高还原强度分类，并重新排序了多种抗氧化剂的还原强度。

　　

作者：Chaz T. Cao, Robert J. Hondal, William E. Geiger

所属机构：美国佛蒙特大学化学系，创新大楼，82 University Place，Burlington，VT 05405

摘要

通过光谱学和电化学方法研究了抗氧化剂麦角硫因（EGT）在生理pH值下的还原能力。光学光谱法用于观察EGT对亚甲蓝、Fe(III)细胞色素c和铁氰化物的还原作用，结果表明，传统上接受的其氧化还原电位值（-0.06 V vs NHE）是不正确的，这导致EGT被归类为比实际更强的还原剂。为了获得更合理的氧化还原电位值，在pH 7.2的磷酸盐缓冲溶液中对EGT进行了循环伏安法（CV）实验。玻璃碳和边缘平面热解石墨工作电极需要经过仔细的机械抛光或等离子体活化处理才能获得可靠的伏安数据。在扫描速率低于或等于0.2 V/s的情况下，实验结果具有重复性。实验表明，EGT的阳极氧化是一个受扩散控制的、完全不可逆的一电子过程。不同碳基电极的阳极峰电位范围为0.42 V至0.47 V，因此可以确定EGT的氧化还原电位为0.45 ± 0.02 V vs NHE。该值略高于抗坏血酸阴离子的公认电位（0.35 V），比之前使用的EGT电位值高出约500 mV。根据目前最可靠的氧化还原电位数据，几种重要抗氧化剂在生理pH值下的还原能力排序为：谷胱甘肽 ≈ 半胱氨酸 >> 抗坏血酸 > α-生育酚 ≈ 麦角硫因 > 酪氨酸。

引言

麦角硫因（EGT）[1]由某些真菌和细菌产生，并通过特定的转运蛋白[1]、[2]、[3]在人体组织中积累。一些人认为它具有潜在的维生素作用，因为已知它对人体健康有益[4]、[5]。其对人类和其他动物的有益效果可能与其抗氧化特性有关[6]。 了解抗氧化剂的化学和生物学效应的一个重要因素是它们的氧化还原电位与它们相互作用的分子和离子（包括细胞内的分子和离子）的氧化还原电位之间的比较[7]。已经使用了多种物理化学方法来确定小分子抗氧化剂的氧化还原电位，这些电位通常以标准氢电极（NHE）为参考。这些电位被用来评估抗氧化剂的还原能力[8]，为阐明它们的电子转移反应的热力学和动力学提供了定量数据[9]、[10]、[11]。 历史上采用的EGT氧化还原电位值（-0.06 V vs NHE，在pH 7条件下）最初出现在1953年的一次研讨会上[12]。该值是基于Ryklan和Schmidt早期的实验结果计算得出的，他们报告在pH 0条件下EGT的氧化电位为0.36 V[13]。在我们其中一位作者的最新评论中，我们对这一值提出了质疑，部分原因是该值表明EGT的还原能力似乎超出了其化学性质所支持的限度[14]。这种质疑最早由Melville提出[15]，他写道（斜体部分为原文）： “……在生理pH值下，麦角硫因对过氧化物或分子氧的抗氧化能力比在强酸中更强（与谷胱甘肽的情况相反）……现在很明显，通过电位滴定法测得的麦角硫因的氧化还原电位可能没有多大参考价值。” 本文的研究旨在澄清EGT的正确氧化还原电位。根据下文的光谱学和电化学数据，正确的电位值明显高于之前的报道值，更符合EGT的抗氧化化学性质。 文献中对抗氧化剂的氧化还原电位的表述方式各不相同，有时存在错误。在这里，我们将抗氧化剂的氧化还原电位简称为E_AO，我们认为这种表示方法比使用“标准”（E^o）或“形式”（E^0’）电位更为合适，因为后者假设的电子转移行为可能并不适用于抗氧化剂的氧化还原过程[16]、[17]。 用于测定E_AO值的方法大致分为两类：化学方法，包括光谱学、核磁共振光谱学、色谱法和电位法，用于观察抗氧化剂与已知半电池电位的氧化剂之间的反应；电化学方法则通过直接伏安分析来测量抗氧化剂的E_AO值。两种方法之间的概念联系在于，电化学方法使用可变电位的电极来替代化学方法中的氧化剂。两者之间的一个显著区别是，电化学方法的实验时间尺度（通常为几秒或更短）远小于滴定方法所需的时间[18]。在本研究中，结合使用了光谱学和循环伏安法（CV）来确定EGT的E_AO值。 鉴于抗氧化剂的氧化过程可能较为复杂，令人欣慰的是，化学方法和电化学方法通常能得到相似的氧化还原电位值。例如抗坏血酸、α-生育酚和酪氨酸（见表1）。然而，含有巯基或硫醇基的抗氧化剂的电位一致性较低。在水溶液中，这些化合物由于电极与抗氧化剂之间的电荷转移缓慢，在异质反应层中表现出较差的伏安行为，导致伏安图上的电位值可能比基于平衡的化学方法确定的电位高出数百毫伏（见表1中的谷胱甘肽和半胱氨酸[19]、[20]）。结果部分讨论了减少伏安法误差的方法。在本研究中，实验条件使得CV扫描能够可靠地确定EGT的E_AO值。

材料与方法

材料：L-抗坏血酸钠盐（99%）及其他所有生化试剂（缓冲液和盐类）均购自ThermoFisher Scientific（Waltham, MA）或其子公司ACROS Organics和Alfa Aesar（L-麦角硫因）。亚甲蓝染料购自SIGMA Diagnostics（St. Louis, MO）。UV-Vis实验使用的是Agilent（Walnut Creek, CA）生产的Cary 50 UV-Vis分光光度计，在1毫升石英比色皿中进行。铁氰化钾（K₃Fe(CN)₆）也来自相同供应商。

光谱分析

I. EGT和抗坏血酸的化学氧化：光学光谱法：观察了EGT被MB、Fe(III)细胞色素c或K₃Fe(CN)₆氧化的反应过程。选择这些氧化剂是因为它们的氧化还原电位（分别为0.01 V、0.26 V和0.36 V，在pH 7条件下）高于之前报道的EGT电位值-0.06 V。同时还观察了这些氧化剂与抗坏血酸之间的反应，后者在pH 7条件下的E_AO电位为0.35 V[21]。

结论

本研究的主要目的是确定EGT在生理pH值（约7-7.2）下的氧化还原电位。通过电化学方法测量，其电位为0.45 V，比传统上认为的值高出约500 mV。因此，不能将EGT归类为在该pH值下的强还原剂。我们的测量结果证实了文献[14]、[15]中对EGT氧化还原电位的质疑，并更好地解释了一些简单的化学现象。

作者贡献声明

William E. Geiger：负责撰写、审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化、验证、软件应用、资源管理、方法设计、实验设计、数据分析、概念构建。 Chaz T. Cao：负责初稿撰写、验证、软件应用、实验设计、数据分析、数据可视化。 Robert J. Hondal：负责撰写、审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化、验证、软件应用、资源管理、项目协调、方法设计。

未引用参考文献

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数据声明

所有数据可应要求提供。

资助信息

本研究得到了美国国立卫生研究院下属的国家通用医学科学研究所（NIGMS）的机构发展奖（IDeA）的支持，项目编号为P20GM103449。研究内容仅代表作者观点，不一定代表NIGMS或NIH的官方立场。

利益冲突声明

作者声明本研究未涉及任何可能被视为潜在利益冲突的商业或财务关系。