《Human Immunology》：The immunosuppressive role of HLA-G+ extracellular vesicles in bone marrow of infiltrating tumors: The lesson learned from neuroblastoma and multiple myeloma
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外泌体通过携带HLA-G等免疫检查点分子调控骨髓微环境，促进神经母细胞瘤和骨髓瘤的免疫逃逸及进展。
伊尔玛·艾罗尔迪（Irma Airoldi）|德博拉·松奇尼（Debora Soncini）|达尼洛·马里姆皮埃特里（Danilo Marimpietri）|米凯莱·切亚（Michele Cea）|法比奥·莫兰迪（Fabio Morandi）
意大利热那亚IRCCS吉安妮娜·加斯利尼研究所（IRCCS Istituto Giannina Gaslini）细胞治疗实验室（UOSD Laboratory of Cell Therapies）
摘要
现已明确，细胞外囊泡（EVs）在癌症进展过程中对骨髓（BM）微环境的调节以及抗肿瘤反应中起着重要作用。实际上，健康细胞和肿瘤细胞通过肿瘤微环境（包括骨髓）中的细胞外囊泡动态传递进行相互作用。这些机制反映了细胞外囊泡的特殊性质，它们能够携带蛋白质和非编码RNA等生物活性物质，从而在短距离和长距离内重新编程肿瘤微环境并调节免疫反应。在这方面，我们和其他研究者发现，肿瘤来源的细胞外囊泡表面携带有免疫检查点分子和免疫抑制分子（如HLA-G）。这些细胞外囊泡通常与疾病进展、肿瘤转移和不良临床结果相关，本文将重点讨论它们在神经母细胞瘤（NB）和多发性骨髓瘤（MM）中的作用。尽管神经母细胞瘤和多发性骨髓瘤在起源和诊断时间上存在显著差异，但它们都具有侵入骨髓并导致骨髓微环境失调的共同特征，而细胞外囊泡在这一过程中起到了关键作用。
引言
细胞外囊泡（EVs）是所有细胞类型在生理和病理条件下释放的小颗粒。它们表面表达四跨膜蛋白和整合素，根据生成方式及大小可分为外泌体（40–120纳米）和微囊泡（50–1000纳米）。外泌体通过内吞途径产生，而微囊泡则直接从细胞膜释放。因此，微囊泡表面通常携带来自母细胞的多种蛋白质和抗原，以及用于区分其类型的特殊磷脂（如磷脂酰丝氨酸）。相比之下，外泌体表面表达四跨膜蛋白CD9、CD63和CD81[1,2]。此外，肿瘤细胞还可以释放肿瘤相关囊泡（oncosomes，1000–10,000纳米），这些囊泡由质膜脱落形成，含有异常的大分子和其他物质。
细胞外囊泡在细胞间通讯中扮演重要角色，并在肿瘤微环境中发挥关键作用，包括骨髓（BM），甚至可以通过生物流体在远距离部位产生影响[3,4]。多项研究描述了肿瘤来源的细胞外囊泡在肿瘤进展、转移灶形成和抑制抗肿瘤免疫反应中的作用[5], [6], [7], [8]。
骨髓是多种驻留细胞的家园，包括造血干细胞（HSCs）和间充质基质细胞（MSCs），这些细胞为HSCs及其他免疫细胞（包括调节造血过程的特异性树突状细胞）提供支持性微环境。在骨髓中，细胞外囊泡在生理条件下作为主要的分子信使，同时也在恶性细胞与骨髓微环境之间构建复杂的对话，从而推动肿瘤进展、免疫逃逸和治疗抵抗[9,10]。这些膜包裹的颗粒通过转移生物活性物质（如蛋白质、脂质和非编码RNA）在骨髓内实现局部和系统性的信号传递[10], [11], [12]（见图1）。
抗肿瘤免疫反应的抑制与肿瘤细胞表面表达的多种分子有关，这些分子可与靶细胞上的受体/配体相互作用，包括免疫效应细胞（如T淋巴细胞、巨噬细胞、调节性B细胞和NK细胞）上的抑制性受体[13]。值得注意的是，细胞外囊泡在肿瘤微环境中的动态转移既发生在癌细胞与免疫细胞之间，也发生在癌细胞与其他类型细胞之间。癌细胞与正常细胞之间释放细胞外囊泡的微妙平衡对肿瘤进展至关重要[13]。细胞外囊泡可能携带非编码RNA和miRNA[14]、免疫抑制细胞因子（如转化生长因子TGF-β-1和IL-10[15], [16], [17]）、免疫检查点分子（如PD-1和PDL-1[9], [10], [11], [12], 18,19]、外酶（如CD73、CD38和CD39[20,21]以及HLA-G[22]）。
HLA-G是一种非经典的HLA-Ib分子，存在七种不同的亚型：表面形式（HLA-G1、-G2、-G3和-G4）和可溶性形式（HLA-G5、-G6和G7），通过与T淋巴细胞、单核细胞和NK细胞表面的抑制性受体相互作用发挥免疫调节作用[23]。HLA-G分子至少与三种受体结合，即免疫球蛋白样转录物（ILT）2、ILT4[24,25]和KIR2DL4[26,27]。其中，ILT2主要识别HLA-G1和-G5，这些受体存在于单核细胞、B细胞、T细胞和NK细胞上[28]；ILT4则识别HLA-G2和-G6亚型，以及无β2M的HLA-G1和HLA-G5，主要存在于单核细胞、中性粒细胞和树突状细胞上[29], [30], [31]；KIR2DL4表达于NK细胞和一部分T CD8+淋巴细胞上，可通过α1结构域识别所有HLA-G亚型[26,32,33]。
多项研究表明，病理状态下细胞外囊泡的表达会增加，这与免疫系统的异常反应有关。例如，在实体瘤和血液系统肿瘤中，HLA-G的表达常增加以逃避免疫监视[36]。HLA-G的表达还与疾病进展、肿瘤转移和不良临床结果相关[36], [37], [38]。在多发性骨髓瘤（MM）和神经母细胞瘤（NB）中，高水平的细胞外囊泡与高风险遗传特征相关（如1号染色体的获得[19]。元分析也证实，在实体瘤中，HLA-G与疾病晚期和不良预后相关[39], [40], [41]。下文将详细讨论HLA-G在多发性骨髓瘤和神经母细胞瘤中的作用。
章节摘录
细胞外囊泡的分离与表征
为了确保细胞外囊泡的纯度和可重复性，其分离和表征需要标准化方法，这符合“细胞外囊泡研究最低信息要求”（MISEV）指南的规定。根据来源不同，可采用以下方法对肿瘤研究中的细胞外囊泡进行严格分析：
细胞外囊泡的分离方法
分离方法的选择至关重要，因为它决定了囊泡的产量和纯度，尤其是在处理血浆等复杂生物流体时。
实体瘤中的HLA-G+细胞外囊泡
近年来多项研究探讨了人类实体瘤和血液系统肿瘤中细胞外囊泡上的HLA-G表达及其功能，强调了这些囊泡作为免疫逃逸介质的重要性。在这些恶性肿瘤中，细胞外囊泡充当“移动检查点”，将肿瘤的免疫抑制作用扩展到直接细胞接触之外。不同类型肿瘤之间的共同点在于它们都涉及抑制性受体的功能参与。
多发性骨髓瘤和神经母细胞瘤：总体特征
最近的研究揭示了细胞外囊泡在患有神经母细胞瘤（NB）和多发性骨髓瘤（MM）的患者骨髓中的作用。神经母细胞瘤是儿童中最常见的颅外实体瘤，发病率约为每百万人10例[59]。该肿瘤起源于神经嵴前体细胞，具有与恶性进程相关的独特生物学特征[60]。神经母细胞瘤可能自发消退，也可能……
多发性骨髓瘤和神经母细胞瘤的共性：HLA-G和细胞外囊泡
神经母细胞瘤和多发性骨髓瘤有一些共同特征，包括骨髓中存在恶性细胞以及不同免疫检查点（包括HLA-G）的表达，这些免疫检查点参与抑制抗肿瘤免疫反应。神经母细胞瘤细胞系和原发性肿瘤中的HLA-G表达和分泌水平较低[66]。相比之下，浸润骨髓的转移性神经母细胞瘤细胞表面表达高水平的HLA-G，并分泌大量的sHLA-G。
神经母细胞瘤和多发性骨髓瘤患者骨髓中的细胞外囊泡特征
纳米追踪分析（NTA）技术用于比较神经母细胞瘤和多发性骨髓瘤患者骨髓血浆样本中的细胞外囊泡与健康供体骨髓中的细胞外囊泡。患者和对照组中的细胞外囊泡大小相似，但神经母细胞瘤和多发性骨髓瘤患者的骨髓血浆样本中细胞外囊泡数量显著更多，表明肿瘤浸润是导致细胞外囊泡释放增加的常见机制。
神经母细胞瘤和多发性骨髓瘤患者骨髓中细胞外囊泡的免疫调节功能
研究发现，从神经母细胞瘤和多发性骨髓瘤患者骨髓中分离出的细胞外囊泡能够在体外通过多种机制调节免疫反应。例如，我们观察到细胞外囊泡能够调节T细胞增殖和细胞因子分泌，尤其是在对Staphylococcus Enterotoxin B（SEB）等共同抗原的反应中。然而，使用从神经母细胞瘤或多发性骨髓瘤患者分离出的细胞外囊泡进行体外实验时观察到了不同的效果。
结论
近年来多项研究描述了在实体瘤和血液系统肿瘤患者骨髓中存在表达HLA-G及其他免疫检查点的细胞外囊泡及其免疫抑制功能。我们的研究支持HLA-G+细胞外囊泡在骨髓中的免疫抑制作用，这为临床标志物的开发提供了依据。
作者贡献声明
伊尔玛·艾罗尔迪（Irma Airoldi）：负责撰写、审稿与编辑、初稿撰写、资料收集、研究设计、资金申请及数据管理。德博拉·松奇尼（Debora Soncini）：负责撰写、审稿与编辑、资料收集、研究设计、数据管理。达尼洛·马里姆皮埃特里（Danilo Marimpietri）：负责撰写、审稿与编辑、资料收集、方法学设计、数据管理。米凯莱·切亚（Michele Cea）：负责撰写、审稿与编辑、资料收集、方法学设计。法比奥·莫兰迪（Fabio Morandi）：负责撰写、审稿与编辑、初稿撰写、数据验证、项目监督。利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。致谢
本项工作得到了Sanofi公司的“Research to Care”项目以及意大利卫生部的支持（项目编号：Ricerca Corrente 2024 n. 2042、5x1000项目，项目编号M-2017-23684161和M-2022-23685490）。同时感谢BioRender.com提供的优秀图形生成工具。
