《Infection, Genetics and Evolution》：Development and evaluation of a whole-virus ELISA for severe fever with thrombocytopenia syndrome virus: Comparison with a recombinant nucleocapsid protein ELISA
编辑推荐：
为解决SFTSV（严重发热伴血小板减少综合征病毒）血清学诊断中，特别是IgM早期检测可靠性有限的问题，本研究开发了一种使用β-丙内酯（BPL）灭活的全病毒颗粒作为抗原的新型间接ELISA（wv-ELISA），并与传统的重组核衣壳蛋白ELISA（rNP-ELISA）进行比较。结果显示，wv-ELISA在IgM检测中表现出100%的灵敏度与特异性，其IgG滴度与中和抗体活性的相关性也更强。该研究为SFTSV的血清诊断和免疫评估提供了一个安全、高效的工具。
在东亚的田野和山林中，一种由蜱虫携带的“隐形杀手”——严重发热伴血小板减少综合征病毒（SFTSV），正悄然构成日益严重的公共卫生威胁。这种病毒引发的疾病以高热、血小板和白细胞减少为主要特征，病死率最高可达27%，尤其对老年人危害巨大，已被世界卫生组织列为优先病原体。目前，临床上诊断SFTSV感染主要依赖于在急性期检测病毒RNA的逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）。然而，病毒RNA通常在发病后约6-12天就难以检出，留下一个诊断“窗口期”。此时，检测患者体内产生的特异性抗体，尤其是感染早期出现的IgM抗体，就成为揪出“元凶”的关键。然而，现有的血清学检测方法，特别是使用单一重组核衣壳蛋白（rNP）的检测法，在灵敏度和特异性上，尤其是针对IgM的检测，仍有提升空间。有没有一种方法，既能像重组蛋白那样安全、标准化，又能像完整病毒那样全面“还原”病毒的真实面貌，从而更精准地捕获人体免疫系统的应答信号呢？
为了回答这个问题，并开发出更优的血清学诊断工具，来自日本长崎大学热带医学研究所的Qiang Xu、Yuki Takamatsu、Mya Myat Ngwe Tun等研究人员在《Infection, Genetics and Evolution》期刊上发表了一项研究。他们致力于建立并评估一种使用灭活全SFTSV病毒颗粒作为抗原的酶联免疫吸附试验（ELISA），并与广泛使用的重组核衣壳蛋白ELISA进行系统比较。
为了开展这项研究，研究人员主要运用了以下几项关键技术方法：首先，利用Vero细胞大规模培养SFTSV毒株（YG1株），并通过聚乙二醇沉淀结合蔗糖密度梯度超速离心技术，纯化出结构完整、高纯度的全病毒颗粒。其次，使用β-丙内酯（BPL）对纯化病毒进行灭活处理，确保实验的生物安全性。接着，将灭活全病毒或重组核衣壳蛋白（rNP）作为包被抗原，分别建立间接ELISA检测体系（wv-ELISA和rNP-ELISA），用于检测SFTSV特异性的IgM和IgG抗体。研究使用了35份经RT-qPCR确诊的SFTSV患者血清和35份健康人血清作为样本队列。此外，研究还采用了免疫捕获ELISA作为IgM检测的参考方法，并通过50%灶减少中和试验（FRNT50）评估血清的中和抗体活性，以分析ELISA测得的抗体滴度与病毒清除及中和功能的相关性。
研究结果部分，作者通过一系列严谨的实验，得出了以下主要结论：
3.1. Purification of the SFTSV whole virus
通过SDS-PAGE和蛋白质印迹（Western Blot）分析证实，研究人员成功纯化出了结构完整的SFTSV全病毒颗粒，其中含有病毒的主要结构蛋白：核衣壳蛋白（NP，~25 kDa）、糖蛋白Gn和Gc（~55 kDa）以及少量RNA依赖的RNA聚合酶（RdRp）。
3.3. Evaluation of IgM detection by rNP-ELISA and wv-ELISA
在IgM检测性能评估中，以免疫捕获ELISA为金标准，wv-ELISA表现出完美的诊断效能。在35份患者血清中，wv-ELISA检测出22份IgM阳性，与金标准结果完全一致，达到了100%的灵敏度、100%的特异性和100%的总符合率。相比之下，rNP-ELISA仅检出20份阳性，其灵敏度为90.91%。此外，wv-ELISA测得的IgM滴度也显著高于rNP-ELISA，进一步证明了全病毒抗原在检测IgM方面具有更高的灵敏度。
3.4. Evaluation of IgG detection by rNP-ELISA and wv-ELISA
在IgG检测方面，wv-ELISA与作为参考标准的rNP-ELISA表现相当。两者对35份患者血清的检测结果完全一致（14份阳性，21份阴性），均达到了100%的灵敏度、特异性和符合率。统计分析显示两种方法测得的IgG滴度没有显著差异，表明对于IgG检测，两者具有可比性。
3.5. Evaluation of the accuracy of the whole virus indirect IgG and IgM ELISA after treatment with BPL
为了确保生物安全，研究人员用0.03%的BPL灭活纯化的全病毒。灶形成试验证实灭活后病毒完全失去感染性。更重要的是，使用BPL灭活病毒抗原与使用未处理病毒抗原进行ELISA检测，所得的吸光度（OD）值没有显著差异。这表明BPL灭活在确保安全的同时，完好地保留了病毒抗原的免疫反应性。
3.6. Correlation of ELISA antibody titers with viral RNA loads and neutralizing antibody responses
相关性分析为wv-ELISA的临床价值提供了有力支持。研究发现，无论是rNP-ELISA还是wv-ELISA测得的IgM和IgG滴度，都与患者体内的病毒RNA拷贝数呈显著负相关，表明更高的抗体水平与更低的病毒载量相关。在评估与中和抗体功能的相关性时，wv-ELISA测得的IgG滴度与FRNT50中和滴度的相关性（相关系数r = 0.8055）显著强于rNP-ELISA（r = 0.6645）。这表明，由于全病毒抗原包含了天然构象的糖蛋白Gn和Gc（它们是中和抗体的主要靶标），wv-ELISA能更好地反映血清中的功能性（中和）抗体水平。
在结论与讨论部分，研究强调了其重要发现与意义。本研究成功建立了一种安全（经BPL灭活）、高效的基于全SFTSV病毒颗粒的间接ELISA检测系统。其核心优势在于：第一，显著提升了IgM检测的灵敏度。 通过保留病毒蛋白的天然结构和更丰富的抗原表位，wv-ELISA成功克服了传统rNP-ELISA在IgM检测中灵敏度不足的瓶颈，实现了100%的检出率，这对于急性期诊断和分子诊断“窗口期”的补充至关重要。第二，在IgG检测中展现了与功能性抗体的更强关联。 wv-ELISA测得的IgG滴度与中和抗体活性高度相关，优于rNP-ELISA，这使得该检测不仅能判断既往感染，还能在一定程度上评估患者的免疫保护水平，在疫苗研发和免疫效果评价中具有潜在价值。第三，兼顾了安全性与抗原真实性。 BPL灭活确保了操作安全，同时又最大程度地保持了病毒抗原的天然免疫原性，为在普通实验室环境下安全、标准化地开展高质量血清学检测铺平了道路。
综上所述，这项研究不仅为SFTSV提供了一种性能卓越的新型血清学诊断工具，更从方法论上证实了使用灭活全病毒抗原在提升抗体（尤其是IgM）检测灵敏度以及更好反映功能性免疫应答方面的独特优势。随着SFTSV地理分布不断扩大的趋势，这种高灵敏度、高特异性且安全的检测方法，将为该病毒的临床诊断、流行病学调查乃至未来的疫苗评估提供重要的技术支持。
